[发明专利]一种具有蛋白质识别功能的血纤维蛋白凝胶及制备方法

说明书

【技术领域】：本发明属于蛋白质识别和分离领域，以生物材料实现对蛋白质的特异性吸附和分离。

【背景技术】：与电泳技术(Huang Y.F.et al.Electrophoresis 2006，27：3503-3522；Dolnik V.Electrophoresis 2006，27：126-141)不同，蛋白质识别及特异性吸附并非是靠蛋白质在电场的作用下通过在大分子外部迁移速率的差异而进行分离的，它的原理是利用大分子结构中能与蛋白质在尺寸和静电上互补的空穴专一性地结合某种蛋白质，使这种蛋白质从其他蛋白质的混合液中被识别或/和分离出来。

以蛋白质为模板溶于单体中，将单体引发聚合，形成包埋着蛋白质的固态聚合物，再用洗涤的方法脱除蛋白质，聚合物结构内部便残留下与蛋白质在形状和静电上互补的空穴(Klibanov A.M.Nature 2001，409：241-246；——Shi H.Q.et al.Nature1999，398：393-397)。这种空穴能够专一性地识别并结合原来的模板蛋白质，而对尺寸大于或小于模板的其他蛋白质则吸附能力很低。

但是，蛋白质由于尺寸较大，难以像小分子模板那样容易从聚合物母体中脱除。这样就影响了空穴的形成，使母体识别能力降低，甚至完全丧失。而降低聚合物的交联密度，增大分子网孔的尺寸又会使母体的机械性能下降。

血液凝固是纤维蛋白原在凝血酶催化下，形成了称为血纤维蛋白凝胶的网状结构(Graeff H.&Hafter R.Semin.Thromb.Hemost.1982，8：57-68)。网络中包裹着大量的血红细胞，白细胞，血小板和各种蛋白质。血纤维蛋白凝胶网络强度高而富有弹性，能形成大网孔而不失其机械性能，是一种较为适宜的识别蛋白质的母体材料。

【发明内容】：本发明目的是克服蛋白质在母体中脱除的难题，为蛋白质识别和分离提供一种新材料和制备方法。本发明以生物材料血纤维蛋白凝胶替代交联聚合物来识别蛋白质，制备一种可对特定蛋白质进行识别和吸附的材料。

本发明提供的具有蛋白质特异性吸附的血纤维蛋白凝胶是一种由来自血液中的血纤维蛋白原，经凝血酶催化形成的一种含有空穴的交联材料。

所述的具有蛋白质识别功能的血纤维蛋白凝胶，是在血纤维蛋白原中加入牛血清白蛋白或牛胰蛋白酶模板分子，在凝血酶催化下交联固化后，再去除模板分子，使材料结构的内部保留与模板分子在形状上互补的空穴而制成的、具有蛋白质识别功能的血纤维蛋白凝胶。

凝血的主要物质是血纤维蛋白原及凝血酶。当凝血酶将血纤维蛋白原带负电的血纤肽切除后，由于血纤维蛋白原失去了静电排斥作用而凝聚成块，同时血纤维蛋白的一个Gln侧链与一个蛋白质的His侧链共价结合生成稳定的血纤维蛋白凝胶。

一种以上所述的血纤维蛋白凝胶的制备方法，包括以下步骤：

第一、烧杯中加入2～3ml血纤维蛋白原，再加入0.2～0.25g牛血清白蛋白或牛胰蛋白酶作为模板，待牛血清白蛋白或牛胰蛋白酶溶于血纤维蛋白原后，滴入0.01ml氯化钙溶液，在37℃水浴中静置5min；

第二、试管中加入凝血酶1.5～2ml，水浴加热3min后与上述血纤维蛋白原溶液混合，搅拌，置于37℃水浴中5min，形成凝块；

第三、将上述凝块切碎，水洗涤，去除模板分子，使材料结构的内部保留与模板分子在形状上互补的空穴，得到黄色弹性粉体即为具有蛋白质识别功能的血纤维蛋白凝胶。

血纤维蛋白凝胶中的这种空穴能够识别并特异性地结合模板蛋白质

——血纤维蛋白凝胶的吸附性能测试：

称取1g血纤维蛋白凝胶分别置于10ml浓度为1.0mg/ml的牛血清白蛋白和牛胰蛋白酶溶液中；浸泡2h，在280nm处分别跟踪两种溶液吸光度的变化。

将制得的血纤维蛋白凝胶分别浸泡在牛血清白蛋白和牛胰蛋白酶溶液中，以牛血清白蛋白为模板制备的血纤维蛋白凝胶对牛血清白蛋白的吸附能力是牛胰蛋白酶的21倍；而以牛胰蛋白酶为模板制备的血纤维蛋白凝胶对牛胰蛋白酶的吸附能力是牛血清白蛋白的34倍。不含空穴的血纤维蛋白凝胶对牛血清白蛋白和牛胰蛋白酶均不具有吸附能力。这是因为牛血清白蛋白的分子质量为68kD，而牛胰蛋白酶的分子质量为23.8kD。两种蛋白质的尺寸不同，分别以它们作为模板在血纤维蛋白凝胶结构中所形成的空穴的尺寸也不相同。而蛋白质更容易吸附在与它尺寸相似的空穴中。