[发明专利]一种乳糖酶膜的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物传感器领域，更具体的说，是涉及一种乳糖酶膜的制备方法。

背景技术

乳糖含量的测定方法主要有：还原糖测定法(碘量法)、旋光测定法、近红外光谱法、核磁共振法、和高效液相色谱、超声波法等，这些方法耗时、繁琐，检测起来既费时又费力。因此，现在普遍看好酶的测定法即乳糖生物传感器法，这种方法具有灵敏、快速、简便、特异性强等特点，而且对样品几乎不用任何预处理。

乳糖传感器的研制为乳糖的现场快速检测提供有利的手段。目前已经出现了各种各样的生物传感器，其中电流型的酶传感器依然是研究最多，也是商品化最为成功的传感器类型，而这类传感器的核心元件就是固定化酶膜。酶膜性能的优劣主要决定于固定化材料的选取和固定方法的选择。

目前在电极上固定化酶的方法主要有吸附法、共价结合法、交联法、聚合物包埋法、组合法等。

为实现乳糖测定，国外已经发明了一些酶电极，这些酶电极主要是通过固定化酶的技术。通过将两种酶：β-GAL和GOD，固定在Clark-型氧电极上，和商业化的氢氧型传感器或白金(Pt)电极上，制成乳糖生物传感器。在这类传感器上直接通过测定过氧化物来计量电化学反应。另外一些电极中酶作用在电极上和一个介导物，例如苯醌结合，这是另一种类型的解决方案。酶也可以和介导物一起固定在电极上，例如Tetrathiafulvalinium、Tetracyanoquinodimethanide(TCNQ)和过氧化物酶(GOD)。介导物增加了酶促反应速率，从而放大了电信号(Ferda Gurtas，1997)。Jan Tka，et al.(2000)采用一种安培计传感器研制出乳糖生物传感器，适合于新鲜原料乳中乳糖的测定。该传感器采用改良玻璃碳电极(GC)，在其上面安排三种酶：β-GAL，GOD，和山葵过氧化物酶(POD)，进行固定化。上述方法中是将酶直接固定到电极上，必须使用相匹配的电极，从而不具有普遍适用性。

发明内容

本发明是为了克服现有技术中将酶直接固定到电极上，从而不具有普遍适用性等不足之处，提供了一种可以和不同氧化还原电极配合使用，并适合于乳糖在线监控的一个核心部件-核微孔固定化酶膜。

本发明通过下述技术方案实现：

一种乳糖酶膜的制备方法，其特征是，包括下述步骤：

(1)称取β-环糊精溶解于含有戊二醛的低浓度氢氧化钠溶液中，室温放置，使之交联成固体状态，用蒸馏水冲洗析出的晶体直到冲洗液的pH值为中性，避光晾干后碾磨，便制得醛基化β-环糊精微球；其中β-环糊精与含有戊二醛的低浓度氢氧化钠溶液的质量体积比为1∶5；

(2)取上述醛基化β-环糊精微球作为固定材料与混合酶溶液充分混合后，4摄氏度下放置8分钟使酶固定化；取0.1g上述固定化的酶均匀涂抹于两张聚碳酸酯微孔膜上，再滴上1滴2％的海藻酸钠溶液，制成三明治结构的酶膜后，浸入CaCl₂溶液后取出，用缓冲液冲洗3遍以上，制成乳糖酶膜；其中固定材料与混合酶溶液的质量体积比为10∶1，所述混合酶溶液由葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、牛血清白蛋白混合而成。

其中，低浓度氢氧化钠溶液中含有体积百分比为0.5-1.5％的戊二醛。所述CaCl₂溶液重量百分比浓度为5-7％。晾干后碾磨的颗粒直径为1nm左右。所述混合酶溶液由0.003-0.007g葡萄糖氧化酶、1ML β-半乳糖苷酶、0.01g牛血清白蛋白混合而成。

本发明具有下述技术效果：

本发明采用和国外研究不同的适合于核微孔膜的固定化酶方法制成固定化酶的核微孔膜，而不是直接固定到电极上，从而适合于山东省科学院生物研究所生产的SBA-40C生物传感分析仪，也可以灵活地和其它氧化还原电极配合使用，具有普遍适用性。该乳糖电极在0.2-2％和4-10％内有良好的线性关系，响应时间40s，半衰期15-20天。葡萄糖电极的线性范围0-1％，分辨率达到0.001％，响应时间20s，半衰期大于60天。该系统可同时测定样品中乳糖和葡萄糖的含量，乳糖电极的葡萄糖干扰用差分法消除。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明详细说明。

实施例1

称取β-环糊精20g，加到100ml含有体积百分比为1％戊二醛的0.2M氢氧化钠溶液中加热溶解搅拌20分钟，室温放置12小时，进行交联反应，之后用蒸馏水冲洗析出的晶体直到冲洗液的pH值降到7.0左右，避光晾干后将其充分碾磨，碾磨的颗粒直径为1nm左右，便制得醛基化β-环糊精微球。装入1.5毫升的离心管中避光保存。