[发明专利]木霉菌酯素的提纯方法

说明书

技术领域

本发明属生物工程技术领域，涉及到微生物发酵液的分离技术，特别涉及到一种南方红豆杉内生真菌紫杉木霉次生代谢产物木霉菌酯素的提取及纯化方法。

背景技术

由立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)引起的纹枯病和立枯病、由灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)引起的灰霉病是农业生产中的重要病害，目前生产上主要靠农业防治和化学防治控制其危害，如灰霉病化学防治主要依赖施佳乐、速克灵等化学药剂。由于抗药性问题等，从天然动植物、微生物中寻找新型生物活性物质，并进行新型生物农药的研究开发是现代农药工业的一个重要研究领域。从南方红豆杉分离得到的内生真菌菌株ZJUF0986(中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保存编号：CGMCC1672)属于一种木霉属新种：紫杉木霉，其产生的新结构化合物木霉菌酯素(trichodermisin)对重要植物病原真菌立枯丝核菌和灰葡萄孢菌有很强的抑制作用(申请号200610050963.5)。研究设计一种高效提取及纯化木霉菌酯素的方法，是研究木霉菌酯素的理化特性及解决木霉菌酯素的生产工艺参数的改进及产品质量控制的关键问题之一。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种简单、高效且回收率高的木霉菌酯素的提纯方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种木霉菌酯素的提纯方法，包括以下步骤：

1)、选用保存编号为CGMCC1672的紫杉木霉菌株ZJUF0986发酵后所得的发酵液；

2)、在上述发酵液中加入助滤剂或絮凝剂搅拌后静止沉淀蛋白，取上清液离心以除去沉淀；

3)、将上述离心处理后的上清液以低极性有机溶剂为萃取剂进行振荡，静止后分离，得水相A和有机相A；

4)、在有机相A中加入干燥剂进行干燥，过滤后减压旋转蒸发，得淡黄色粗提物；

5)、将淡黄色粗提物用低极性有机溶剂溶解，然后再以去离子水为萃取剂进行振荡，静止后分离，得水相B和有机相B；

6)、在有机相B中加入干燥剂进行干燥，过滤后减压旋转蒸发，得无色重提物。

作为本发明的木霉菌酯素的提纯方法的改进：将上述无色重提物用氯仿溶解，过硅胶柱纯化，辅以包括高效薄层层析及活性追踪的办法获得木霉菌酯素的纯品。

作为本发明的木霉菌酯素的提纯方法的进一步改进：步骤2)中的助滤剂或絮凝剂的用量是发酵液重量的0.1％～1.0％；搅拌后静止12～24小时沉淀蛋白，离心条件为：5000～10000rmp/min，室温下离心5～10min。

作为本发明的木霉菌酯素的提纯方法的进一步改进：步骤3)中，室温条件下以低极性有机溶剂为萃取剂分1～5次进行萃取，所述离心后的上清液与低极性有机溶剂的体积比为1∶0.5～2；每次萃取中：振荡时间为5～10min，静止时间为1～5小时。

作为本发明的木霉菌酯素的提纯方法的进一步改进：步骤4)中干燥剂的用量为有机相A重量的5％～10％；步骤6)中干燥剂的用量为有机相B重量的5％～10％；步骤4)和步骤6)均为用滤纸过滤后，在负压0.08MPa、50℃的条件下旋转蒸发浓缩，以回收有机溶剂。

作为本发明的木霉菌酯素的提纯方法的进一步改进：步骤5)中，首先将淡黄色粗提物在10～50℃的温度下用低极性有机溶剂溶解；然后在室温条件下以去离子水为萃取剂分1～5次进行萃取，去离子水的用量是淡黄色粗提物体积的100～500倍；每次萃取中：振荡时间为5～10min，静止时间为1～5小时。

作为本发明的木霉菌酯素的提纯方法的进一步改进：助滤剂可选用硅藻土助滤剂、珍珠岩助滤剂或粘胶棉助滤剂，絮凝剂可选用硫酸铝钾、聚合硫酸铝铁、甲壳素或高分子聚壳糖。低极性有机溶剂可选用石油醚(60～90)、或石油醚(30～60)或乙酸乙酯。干燥剂可选用无水硫酸钠、无水碳酸钾或无水硫酸钠。

作为本发明的木霉菌酯素的提纯方法的进一步改进：硅胶柱为直径4cm、长为50cm的玻璃柱；无色重提物用氯仿溶解后拌入层析硅胶，用干法上样；将层析硅胶活化后与氯仿混匀，并用超声波赶除气泡后湿法装柱；平衡后，放出氯仿至硅胶柱上表面，按极性从小到大顺序，选择不同梯度的氯仿/甲醇作洗脱剂进行洗脱，收集洗脱液；分别将各单位洗脱液浓缩后配制成甲醇溶液，采用高效薄层层析色谱追踪斑点，选择最优化展开剂系统，以254nm及365nm的紫外光照射或碘蒸汽显迹，同时以终极腐霉、立枯丝核菌、灰葡萄孢为指示菌，用滤纸片法进行活性追踪；最终获得木霉菌酯素的纯品。