[发明专利]NF－κB位点缺失的DC－SIGN启动子真核质粒的构建方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及NF-κB位点缺失的DC-SIGN启动子真核质粒的构建方法。

背景技术

HIV-1传播首先需要将病毒从粘膜表面的感染部位转运到二级淋巴组织的T细胞区，进一步在CD4+T细胞进行病毒复制。病毒的早期传播机制目前还不清晰，但根据不同造血谱系细胞的体外感染研究提示，皮肤和粘膜表面的不成熟DC可能是HIV-1的第一靶细胞，起着识别和结合HIV的作用。而DCs表面的树突状细胞特异的胞间黏附分子-3捕获非整合素(DC-Specific Intercellular Adhesion Molecule-3-Grabbing Nonintegrin，DC-SIGN)在识别、结合和转运HIV的过程中起着重要的作用。

作为黏附分子受体，DC-SIGN通过结合ICAM-3，促使DC和T细胞相互作用；通过和ICAM-2相互作用，使DC细胞在内皮进上黏附游走；作为病原微生物的识别受体，DC-SIGN可以和HIV-gp120蛋白高亲和力结合，把HIV从粘膜受感染部位运输到引流淋巴结，在那里感染T淋巴细胞。但是DCs本身却被感染，成为体内HIV病毒聚集和携带的载体，起着浓缩和转运HIV的作用。然后，通过DC的迁移到达引流淋巴结，促进靶细胞的感染。此外，DC-SIGN还通过in trans机制加速AIDS的进程。这些研究结果表明，DC-SIGN在HIV-1感染和传播及AIDS病情进展方面具有重要意义。

通过原位染色技术发现，DC-SIGN在体内表达相对局限，主要表达于皮肤和粘膜固有层，肠道淋巴节和胎盘等处，而在其它部位较少表达。DC-SIGN表达的局限性提示DC-SIGN表达有特异性，可能在表达调控上受特异机制调节。在真核细胞，基因的表达主要受基因的启动子和增强子等基因元件调节，但是，目前有关DC-SIGN表达调控机制尚不完全清楚。作为核转录因子的NF-κB，有着广泛的生物学活性，在机体的主动核和被动免疫调节方面发挥着核心作用，和信号转导，抗凋亡，肿瘤发生等方面密切相关。NF-κB和DC的关系也十分密切。很多病原微生物可以识别DCs表面的TLR受体，从而启动NF-κB的表达，导致DCs分泌细胞因子和化学因子，促使DC细胞的成熟。目前有研究发现，IL-4可诱导DC-SIGN表达，主要是通过STAT途径来实现的。但是IL-4调节细胞表达的详细机制尚存作争论：有研究认为，IL-4是通过抑制NF-κB的表达来实现IL-4的生物调节功能的，而另外的研究则认为，IL-4发挥其生物活性是经过STAT6和NF-κB直接的相互作用来实现的，STAT6和NF-κB在细胞内直接联系，并具有协同效应。

无论何种机制，NF-κB无疑在DC-SIGN启动子的表达调控中起重要作用，研究NF-κB与DC-SIGN启动子的作用机制很有必要。因此，构建NF-κB位点缺失型DC-SIGN启动子真核质粒十分必要。

发明内容

本发明的目的是提供NF-κB位点缺失的DC-SIGN启动子真核质粒的构建方法。

我们通过通过设计用Ecor I酶切位点替代NF-κB位点的DC-SIGN启动子NF-κB位点上下两端引物，将DC-SIGN启动子报告质粒重的启动子序列分两端扩增，再通过酶切、连接及PCR扩增等方法重新得到NF-κB位点缺失的DC-SIGN启动子片段，将该片断插入pGL3-Basic质粒，成功构建了NF-κB位点缺失型DC-SIGN启动子真核质粒。通过与pGL3-Basic空质粒，DC-SIGN启动子质粒DSPGB和阳性对照质粒pGL3-Control在各种PMA、IL-4刺激情况下的活性进行比较，证实了所构建真核质粒NF-κB位点的缺失。具体方案如下：

(1)参考GeneBank AF209479的DC-SIGN启动子序列，设计DC-SIGN启动子的一对引物，在5’端和3’端分别引入Mlu I和Bgl II识别位点：ACGCGT和AGATCT，所用的上游引物为sense primer：ATCATACGCG TATGAGTCCT TCTCCCTGTC，antisenseprimer：TGTAAGATCT GTCACCCCAC TCTCCCCCAG，用PCR法高保真扩增DC-SIGN启动子片段，并纯化PCR产物，备用；

(2)对DC-SIGN启动子片段和它的表达载体pGL3-basic分别进行双酶切，并将纯化后的酶切产物进行连接，连接产物转化DH-5α感受态细胞，挑单个白色菌落扩增，抽提重组质粒DNA，作双酶切鉴定；