[发明专利]一种用于富集磷酸化肽段的聚合物材料的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及磷酸化肽段的分离纯化，具体的说是一种用于富集磷酸化 肽段的聚合物材料的制备方法。

背景技术

蛋白翻译后修饰位点的鉴定是目前蛋白组学研究中重要挑战之一，磷 酸化修饰是蛋白翻译后最重要的修饰之一。因为可逆的蛋白磷酸化修饰反 应在细胞的信号传导，新陈代谢等方面调节着蛋白的活性功能。最近，质 谱技术在蛋白磷酸化的定性中，已经发展成为重要的工具之一。在磷酸化 蛋白酶解产物的磷酸化肽段质谱分析中，由于酶解产物中存在大量的非磷 酸化肽段，这些肽段在离子化过程中产生的离子信号会淹没磷酸化肽段的 离子信号，另一方面因为磷酸化肽段在质谱检测中相对较低的离子化效率， 这些因素导致了磷酸化肽段在质谱中很难被检测。从磷酸化蛋白的酶解混 合物中分离和富集磷酸化肽段是目前进行磷酸化研究的比较理想的方法， 也是成功实现质谱分析最关键的一步。为了提高对磷酸化肽段的检测，亲 和技术被应用到从复杂的混合样品中纯化和富集磷酸化肽段。最常用的亲 和技术是固定化金属离子螯合亲和色谱(IMAC)，磷酸肽在IMAC上的保留 是基于其与固定相的螯合离子之间的螯合作用。常用的金属离子是铁(Fe³⁺) 和镓(Ga³⁺)，一般利用亚氨基二乙酸(IDA)为螯合基团将金属离子固载在 色谱介质上。虽然基于铁和镓的IMAC很常用，但是其特异性不强，一些 酸性肽也会保留从而干扰磷酸肽的检测。

基于利用锆离子和磷酸基团之间的强烈相互作用，最近我们发展 出了基于磷酸酯锆的新IMAC方法(Zr⁴⁺-IMAC)。与常规IMAC相比， 该方法对磷酸化肽有更好的特异性。不同于一般的IMAC，在Zr⁴⁺-IMAC 中所用的螯合基团也是磷酸基团。在使用中首先将锆离子固载于磷酸基 团修饰的介质表面上形成磷酸酯锆表面，磷酸化肽由于其磷酸基团与 锆离子之间的强相互作用而获得特异性保留。为了制备这种带有磷酸基 团的色谱吸附材料，需要对材料表面进行改性，这需要多步化学反应，因 此比较费时费力。本发明提供了一种更为简单的制备这种材料的方法。

发明内容

本发明目的在于提供一种用于富集磷酸化肽段的吸附材料的制备方 法。该方法利用带磷酸基团的单体进行聚合反应形成带磷酸基团的聚合物， 该聚合物敖合Zr⁴⁺后，可用于磷酸化肽的高特异性富集。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种用于富集磷酸化肽段的聚合物材料的制备方法，采用带有烯键和 磷酸基团的化合物单体，进行聚合反应，形成磷酸基团聚合物，该材料经 与锆离子作用后生成磷酸酯锆基团，可用于富集磷酸化肽段等带有磷酸基 团的化合物。

所述带有烯键和磷酸基团的化合物具有如式(I)结构，

R为CH₂、CH₂CH₂、CH₂CH₂CH₂之一，磷酸基团以磷酸酯键存在于 单体中，为磷酸一酯。

具体过程为，

1)以采用带有烯键和磷酸基团的化合物为功能单体、亚甲基双丙烯酰 胺作为交联剂，加入有机致孔剂，形成反应物料，进行热引发聚合反应， 形成磷酸基团聚合物；

功能单体与交联剂的质量比为75-85∶55-65，致孔剂的加入量为反应 物料体积的75～85％；反应温度为50～80℃；

2)将磷酸基团聚合物与10-100mM锆离子溶液接触，生成磷酸酯锆基 团，其可用于富集磷酸化肽段或带有磷酸基团的化合物。

本发明具有如下优点：

本发明利用带磷酸酯基团的单体进行聚合反应直接形成带磷酸基团的 聚合物，其聚合物材料可以制备成整体柱模式，也可以制备成颗粒状态。

该方法通过聚合反应的方法直接制备出带有磷酸基团的吸附材料，不 用对材料进行额外的化学反应，因而具有简单、方便的特点。

附图说明

图1为单体2-(甲基丙烯酰氧)乙基磷酸酯与交联剂亚甲基双丙烯酰 胺聚合反应的化学表达式。

图2为聚合物吸附材料富集和检测磷酸肽的过程。

图3为聚合物整体材料对磷酸化蛋白-酪蛋白酶解液中的磷酸化肽 段的的富集和纯化的MALDI质谱图。