[发明专利]一种酿酒酵母及其在制备β－羟基苯丙酸乙酯中的应用

权利要求书

1.一种酿酒酵母菌株CGMCC No.2230，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心，保藏日期2007年10月24日，保藏编号CGMCC No.2230。

2.如权利要求1所述的酿酒酵母菌株CGMCC No.2230在β-羰基苯丙酸乙酯微生物转化制备β-羟基苯丙酸乙酯中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的应用为：以β-羰基苯丙酸乙酯为底物，以酿酒酵母菌株CGMCC No.2230发酵获得的发酵液再制得的固定化细胞颗粒为生物催化剂，在水/邻苯二甲酸二丁酯两相体系中，于25～30℃转化反应8～72小时，转化液经分离纯化得到产物β-羟基苯丙酸乙酯，在水/邻苯二甲酸二丁酯两相体系中底物β-羰基苯丙酸乙酯的初始浓度为5.15～51.5mmol/L。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于每L水/邻苯二甲酸二丁酯两相体系中含有的菌体干重相当于以包埋法将0.330L菌体浓度为3.0～10.0g/L的发酵液制成固定化细胞颗粒在液体培养基中增殖培养16～72小时后获得的增殖培养后的固定化细胞颗粒的菌体干重；所述发酵液中菌体浓度定义为：菌体干重/发酵液体积。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述的生物催化剂通过酿酒酵母菌株CGMCC No.2230发酵获得的发酵液以包埋法制得，具体制备步骤如下：将经酿酒酵母菌株CGMCC No.2230发酵培养获得的发酵液与等体积1～5％的海藻酸钠溶液相混合，所述的发酵液菌体浓度为3.0～10.0g/L，搅拌均匀得到混合液，将混合液逐滴滴入质量浓度为2.5～4.0％的氯化钙溶液中，连续搅拌，含有菌体的海藻酸钠混合液固化形成凝胶珠固定化颗粒，将得到的固定化悬浮液放置于35～38℃条件下固化，得到的固定化颗粒用无菌生理盐水洗涤，获得固定化细胞颗粒，将固定化细胞颗粒分散于发酵培养基中进行增殖培养16～72h获得增殖培养后的固定化细胞颗粒，获得的增殖培养后的固定化细胞颗粒即为所述的生物催化剂。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述的固定化细胞颗粒的直径为1～5mm。

7.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述的水/邻苯二甲酸二丁酯两相体系的组成如下：将水与邻苯二甲酸二丁酯以等体积混合构成两相体系。

8.如权利要求3～7之一所述的应用，其特征在于所述的应用按如下方法获得发酵液：

(1)斜面培养：将酿酒酵母CGMCC No.2230菌体接种到斜面培养基，26～35℃培养4～6天得环菌体；所述的斜面培养基组成(g/L)：麦芽汁0.5～1.5％，酵母粉0.2～0.4％，蛋白胨0.4～0.6％，葡萄糖0.7～1.2％，琼脂1.5～2.5％，自然pH值，溶剂为水；121℃灭菌20min，灭菌后冷却制成斜面；

(2)种子培养：从斜面培养基取一环菌体转接到种子培养基，26～35℃，摇床转速为150～200r/min，培养18～26h得种子液；所述的种子培养基组成(g/L)：葡萄糖2.6～3.2％，酵母粉0.2～0.4％，硫酸铵0.3～0.6％，无水MgSO₄ 0.02～0.04％，K₂HPO₄·3H₂O 0.05～0.15％，KH₂PO₄ 0.06～0.15％，自然pH值，溶剂为水；121℃灭菌20分钟，灭菌后冷却，即得种子培养基；

(3)发酵培养：取种子液，以10～20％的接种量接种于发酵培养基中，培养温度为26～35℃，摇床转速为150～200r/min，培养18～30h得到发酵液；所述的发酵培养基的组成同种子培养基。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于将所述生物催化剂具体按如下方法获得：将发酵液与等体积2％的海藻酸钠溶液相混合，所述的发酵液菌体浓度为4.3g/L，搅拌均匀得到混合液，将混合液逐滴滴入质量浓度为3.5％的氯化钙溶液中，连续搅拌，含有菌体的海藻酸钠混合液固化形成凝胶珠固定化颗粒，将得到的固定化悬浮液放置于37℃条件下固化，得到的固定化颗粒用无菌生理盐水洗涤，获得固定化细胞颗粒；得到的固定化细胞颗粒分散于发酵培养基中进行增殖培养24h，获得增殖培养后的固定化细胞颗粒，以增殖培养后的固定化细胞颗粒作为生物催化剂。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于所述的应用为：以增殖培养后的固定化细胞颗粒作为生物催化剂，以β-羰基苯丙酸乙酯为底物，在体积比1∶1的水/邻苯二甲酸二丁酯两相体系中，于30℃、180r/min条件下转化反应72小时，转化液经分离纯化得到β-羟基苯丙酸乙酯；所述分离纯化步骤如下：将转化液过滤除去固定化细胞颗粒，得到的滤液静置分层，萃取分出有机相，将有机相层旋转蒸发除去溶剂邻苯二甲酸二丁酯，得到有机溶质混合物，得到的溶质混合物采用硅胶柱层析分离，获得产物β-羟基苯丙酸乙酯；在水/邻苯二甲酸二丁酯两相体系中底物β-羰基苯丙酸乙酯的初始浓度为5.15～51.5mmo1/L，每L水/邻苯二甲酸二丁酯两相体系中含有的菌体干重相当于以包埋法将0.330L菌体浓度为4.3g/L的发酵液制成固定化细胞颗粒在发酵培养基中增殖培养24小时后获得的增殖培养后的固定化细胞颗粒的菌体干重。