[发明专利]人促红细胞生成素的纯化工艺

说明书

技术领域

本发明涉及蛋白质纯化领域。更具体地，本发明提供了一种高效生产重组人促红细胞生成素(rhEPO)的纯化方法。

背景技术

促红细胞生成素(erythropoietin，简称EPO)最早于1906年被发现。EPO属唾液糖蛋白激素，为人体内源性化合物，相对分子质量为34,000道尔顿，由165个氨基酸组成。它主要来源于肾脏(少量来源于肝脏)，由皮质管周围的间质细胞合成。由基因重组技术合成的rhEPO相对分子质量为30,400道尔顿，其理化性质和生物学活性与天然内源性红细胞生成素相同。其不同点是基因位点在7号染色体为糖蛋白。EPO的生理作用是通过它与幼红细胞集落形成单位(CFu-E)或其早幼阶段的红细胞系爆裂形成单位(BFu-E)的受体结合，并促进其向红细胞前体(网织红细胞)和原红细胞分化，最后生成红细胞(RBC)。当人的肾功能发生严重损害时，如在急慢性肾衰竭或肾切除的情况下，EPO的产生减少，出现贫血。因此EPO对绝大多数肾性贫血患者均有很好的疗效。在基因重组技术诞生之前，EPO主要从贫血患者的尿和绵羊血中提取，提取率非常低，且极不稳定，理化和生物性质难以测定，亦无法大规模应用。1985年人EPO基因克隆和表达的成功，使rhEPO的制备成为现实。1989年美国FDA已批准rhEPO的临床试用，日本，法国等也批准其上市，主要用于肾透析贫血患者的治疗。大量的临床试验证明，rhEPO不仅对肾性贫血疗效好，对非肾性贫血也有良好的治疗前景，是抗贫血药物研究中的重大进展。

人红细胞生成素(hEPO)是健康人的肾分泌的，能够促进红细胞生成的细胞生长因子，临床用于治疗肾衰竭、贫血，与抗艾滋病药物叠氮胸苷合用可以治疗艾滋病、改善癌症引起的贫血，还可用于预防手术中的失血，具有促进自身输血作用。

本发明经过大量的优化后，获得了高纯度的重组人促红细胞生成素(rhEPO)的纯化方法。通过该方法，每升发酵罐培养液可获得4.9×105IU以上、纯度大于95％重组人促红细胞生成素。

发明内容

本发明的目的就是提供一种高效和/或简便的纯化重组人促红细胞生成素的方法。

在本发明的第一方面，提供了一种重组人促红细胞生成素纯化方法，该方法包括步骤：

i)根据重组人促红细胞生成素的发酵表达形式，采取合适的方式获得含有重组人促红细胞生成素的液体；

ii)对发酵上清进行层析纯化，所述的层析选自：阴离子交换层析、反相层析、凝胶过滤层析及其组合。

通过以上方法，可以获得纯度大于95％、得率在20％以上的重组人促红细胞生成素纯品。

在本发明的一优选例中，含有重组人促红细胞生成素的液体经阴离子交换层析(DEAE Sepharose F.F)、反相层析(RPC30)、凝胶过滤层析(S200)得到纯度大于95％、活性得率在20％以上的纯品。

附图说明

无。

具体实施方式

本发明人通过深入而广泛的研究，通过对EPO蛋白理化性质的分析，纯化工艺条件的摸索，从而实现了人EPO的高效纯化工艺。在此基础上完成了本发明。

对表达的重组人促红细胞生成素蛋白进行分离纯化。通常，如果表达的重组人促红细胞生成素蛋白在发酵上清，则发酵液先离心或过滤获得细胞上清；如果表达的重组人促红细胞生成素蛋白在发酵菌体内，则发酵液先离心或过滤获得细胞，然后细胞破碎获得含有重组人促红细胞生成素蛋白的液体。

将含有重组人促红细胞生成素蛋白的液体依次经阴离子交换层析(DEAESepbarose F.F)、反相层析(RPC30)、凝胶过滤层析(S200)，可以获得高纯度的重组人促红细胞生成素蛋白。

由于本发明的重组人促红细胞生成素的表达存在于发酵上清，所以，发酵液通过离心，获得发酵上清，含有重组人促红细胞生成素。

在本发明的一个实例中，发酵上清经一系列纯化步骤后可得到纯品得率95％以上，活性为4.9×10⁵IU/L。

中试研究表明，产品制造工艺稳定，操作简单，周期短，成本低，每升细胞上清可获得重组人促红细胞生成素纯品4.9×10⁵IU，适合产业化生产。

本发明的优点在于：

1)确定了较佳的工艺路线，纯化工艺流程简单；

2)能得到高纯度高活性的重组人促红细胞生成素蛋白，每升发酵罐培养液可获得活性在4.9×10⁵IU以上、纯度大于95％重组人促红细胞生成素。