[发明专利]人促红细胞生长素的基因工程生产方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域。更具体地，本发明提供了一种重组人促红细胞生长素的编码序列以及生产该重组人促红细胞生长素的方法，包括有关的工程菌的构建、重组人促红细胞生长素的表达和纯化工艺。

背景技术

人类促红细胞生成素(Human Erythropoietin，huEPO)是一种糖蛋白，是人体内调节红系造血的一种主要激素，对体内红细胞的生成起着不可或缺的调控作用。天然EPO来源极为有限，远不能满足需要。

胎儿肝脏是胎儿EPO的主要来源，出生后EPO合成器官由肝脏转变为肾脏。成年机体EPO主要来源于肾脏，由肾小管及管旁毛细血管内皮细胞及间质细胞合成分泌。大约机体EPO总量的10～15％来自于肾外，主要合成器官为肝脏，由肝中央静脉周围肝细胞及肝枯否细胞产生，骨髓中的巨噬细胞和中枢神经系统中的星形胶质细胞可能以旁分泌方式也可合成EPO。另外研究发现EPO亦可经一些肾脏和肝脏肿瘤，脑血管瘤，子宫肌瘤及卵巢囊肿等合成。

促进EPO合成的主要刺激因素为血中可利用氧下降引起的组织缺氧。在缺氧情况下，EPO合成增多，见于各种贫血，心肺功能紊乱等引起的动脉血氧分压降低。EPO的合成亦受到多种体液因素及一些具有免疫调节作用的细胞因子的影响。

人EPO基因位于第七对染色体的q21-q22区，至少含有5个外显子和4个内含子。与鼠EPO基因序列存在82％的同源性。EPO转基因小鼠研究显示，位于EPO基因两侧的不同DNA序列(即侧翼序列)控制着肾、肝脏EPO基因的表达，大约50个核苷酸组成的3’端侧翼序列能传递对缺氧产生的转录诱导，作为增强子发挥作用。

人EPO是一种对热和酸稳定的酸性糖蛋白，其前体由193个氨基酸组成。成熟的人EPO分子由166个氨基酸残基组成，含有2个二硫键，理论相对分子量为18kDa。

EPO分子中有三个N-连接糖基化位点，分别位于24、26、83位的Asn和126位的Ser。成熟的EPO分子在这几个位点均可被糖基化。糖基化在体内的作用是很复杂的，机体可合成多种不同类型的糖基化EPO，糖基化类型不同作用亦不相同。近来研究显示，仅能进行N-连接而不能进行O-连接的糖类对EPO功能的产生具有重要意义。

EPO能刺激红系祖细胞分化发育成成熟的红细胞。早期EPO主要从尿中提取，用于治疗肾功能衰竭引起的贫血。EPO以其重要的生理作用和极高的临床应用价值而成为最有利可图的基因工程药。随着分子生物学研究的进展，国外已经研制出了重组人红细胞生成素(rhEPO)应用于临床，对慢性肾功能衰竭等原因引起的并发贫血的患者，具有极好的疗效。而在国内，有关反面的研究并不多。

因此，迫切需要开发新的高效生产重组人EPO方法，本发明采用了酵母表达系统表达EPO，通过对人EPO基因的优化，构建含有优化的人EPO基因的表达载体，并获得了高水平的表达菌株；通过控制发酵条件，达到了较高蛋白表达率；得到可供动物实验的EPO蛋白。

发明内容

本发明的目的就是提供一种高效和/或简便的生产重组重组人红细胞生成素(rhEPO)的方法。

本发明的另一目的就是提供优化的重组人红细胞生成素(rhEPO)的编码序列和用于该方法的表达载体，工程菌株以及宿主细胞的培养和纯化工艺。

在本发明的第一方面，提供了一种优化的编码重组人红细胞生成素(rhEPO)的核苷酸序列。

在本发明的第二方面，提供了一种表达载体，含有权利要求1所述的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述的表达载体是pPIC9/EPO和pPIC9k/EPO。

在本发明的第三方面，提供了一种工程细胞，其特征在于，含有权利要求2所述的表达载体。