[发明专利]卡介苗多糖核酸—DDA佐剂的制备及应用

权利要求书

1.卡介苗多糖核酸——DDA佐剂，其特征为卡介苗多糖核酸——DDA佐剂的制备方法为：

(1)菌种传代与培养

将保存于2-8℃的卡介苗冻干菌种取出复溶，在苏通培养基上共培育3-12代；

(2)菌体收集

收集培养基表面的菌膜，注入离心管,在3-5℃离心，弃上清，将沉淀的菌体用蒸馏水配成混悬液，用比浊法确定菌液浓度，细菌在冰浴中破碎2-4h；

(3)提取

菌液与1.5-3倍体积45％苯酚醋酸钠混匀，在65-70℃水浴中保持30-50min，然后移入3-5℃的冰浴，将菌液无菌转移至离心管，在3-5℃下离心，弃沉淀，收集上清，重复以上操作直至水相与酚相交界面无蛋白沉淀；

预处理透析袋，将上清液装于透析袋中，在大体积的烧杯中流水透析10-15小时，随后用蒸馏水透析72小时，将透析袋中的液体全部转移至烧杯中，加入两倍体积的冰冷无水乙醇，以1∶10体积比例加入生理盐水，转至离心管中离心，分别以乙醇、乙醚混匀洗涤三次，在3-5℃下离心，收集沉淀并称重，按1mg/ml重悬于蒸馏水，分装入安瓿中，放冷冻干燥器中干燥成粉末状的卡介苗多糖核酸冻干制品；

(4)配苗

分别将卡介苗多糖核酸冻干制品用生理盐水溶解至0.6mg/ml，融合蛋白AMM用PBS稀释至1mg/ml；DDA用注射用水配制成2.5mg/ml，在70-85℃水浴中加热10min，取卡介苗多糖核酸溶液40-60μl与等量AMM蛋白充分混匀室温放置1min，加入80-120μl DDA然后充分乳化，最后疫苗呈均一的乳油状。

2.根据权利要求1所述的卡介苗多糖核酸——DDA佐剂，其特征为在结核亚单位疫苗中作佐剂应用。