[发明专利]一种复制缺陷型重组腺病毒

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种使用Ad5/F35腺病毒载体和AdMax腺病毒包装系统构建的含有外源DNA片段的复制缺陷型重组腺病毒，该重组腺病毒能够有效抑制肿瘤细胞APE1基因的表达，可有效增强对肿瘤细胞放疗和化疗的敏感性。

背景技术

DNA损伤修复系统作为机体抵抗各种损伤的分子基础，对于维护基因组的稳定与完整起着至关重要的作用，然而对于通过损伤DNA杀死癌细胞的放、化疗，这一过程无疑削弱了治疗效果。因此以DNA损伤修复基因为靶点的基因治疗可望有效增强肿瘤细胞自身对放疗和细胞毒化疗药物的敏感性。

APE1是迄今发现的生物大分子中最具结构和功能特点的一个典范，它由DNA修复和氧化还原两个相对独立的功能区构成。APE1是DNA碱基切除修复(base excision repair，BER)途径的关键限速酶^[1]，是细胞放射性损伤和基因毒性药物烷化剂致伤的重要修复因子，在肿瘤放化疗抵抗中发挥重要作用。

APE1还具有氧化还原功能，故又称为氧化还原因子(redox factor，ref-1)，通过氧化还原机制调节多种转录因子的DNA结合活性及下游靶基因表达，而参与氧化应激、细胞周期调控及凋亡等多种关键的细胞反应。受控的转录因子包括与细胞增殖、分化、转化和凋亡相关的重要因子如NF-κB，AP-1，Egr-1，p53，PEBP2，Myb，HIF-1α及Pax5、8等^[2]，而这些转录因子与肿瘤放化疗抵抗密切相关。因此APE1通过核酸内切酶和氧化还原双功能直接影响和决定放疗和化疗敏感性的诸多环节，以APE1为靶点的基因治疗可望有效增强肿瘤细胞的放化疗敏感性。如何有效抑制APE1基因的表达将是决定临床应用的关键。

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是一种由双链RNA诱发的基因沉默(gene silencing)。在此过程中，与双链RNA有同源序列的信使RNA(mRNA)被降解，从而抑制了该基因的表达。目前RNAi已成为基因组研究领域中的重要工具，正逐渐应用于肿瘤基因治疗领域。基因导入系统(gene delivery system)成为基因治疗和RNAi技术应用的关键。病毒载体因其对细胞天然的感染性而成为重要的基因导入手段。可用于导入siRNA的病毒载体有腺病毒载体、逆转录病毒载体和AAV载体等。

腺病毒载体具有包装容量较大、制备方便且易纯化和浓缩、宿主范围广、感染效率高、无DNA整合等特点，是目前基因治疗研究和临床试验中应用最广泛的病毒载体之一^[3]。目前应用于基因治疗腺病毒载体极大多数采用C种的2及5血清型腺病毒，其对细胞的感染主要是由纤毛上的小节与细胞表面受体-柯萨奇B组病毒和腺病毒受体(Coxsackie Bvirus-adenovirus receptor，CAR)结合，腺病毒对组织的感染主要取决于组织CAR的表达水平。在人体中，CAR广泛表达于各种上皮组织，而在肿瘤组织中存在CAR不同程度的下调或缺失，系统应用的腺病毒往往被截留在正常上皮细胞，尤其是肝细胞，因此肿瘤细胞感染的病毒量大大减少。因此，本发明人一直在寻找能够进一步提高肿瘤细胞感染效率的腺病毒载体。

Ad5/F35腺病毒载体是一种″改外壳″的腺病毒嵌合载体(Chimericadenovirus)，即用Ad35的纤毛小节替代第一代腺病毒5型腺病毒的纤毛小节。Ad35属腺病毒B种，对人的多数细胞具有良好的感染效率，因为其受体CD46几乎存在于所有的人细胞表面，而且许多肿瘤细胞高表达CD46。因此Ad5/F35腺病毒载体成为肿瘤细胞适合的基因导入载体。

发明内容

基于APE1基因在肿瘤放疗和化疗抵抗中发挥重要的作用，有效抑制APE1基因的表达，开展以APE1基因为靶点的基因治疗可望有效增强肿瘤细胞的放疗和化疗敏感性，提高临床肿瘤放疗和化疗的治疗效果。正是基于上述构思，发明人提出以Ad5/F35腺病毒载体作为肿瘤细胞适合的基因导入载体，将APE1基因的siRNA的编码序列插入腺病毒载体中构建一种重组腺病毒，使其能够在肿瘤细胞中表达，利用RNAi可以有效抑制APE1基因表达，达到增强对肿瘤细胞放疗和化疗的敏感性的目的。

本发明的目的是提供一种复制缺陷型重组腺病毒，该复制缺陷型重组腺病毒以DNA修复基因APE1为治疗靶点，利用RNAi技术有效抑制APE1基因表达，增强肿瘤细胞放化疗敏感性。

本发明的技术方案如下：