[发明专利]一种钩端螺旋体的检测方法

权利要求书

1.一种钩端螺旋体的核酸检测方法，其特征在于通过使用特异性引物，利用LAMP技术平台扩增靶基因的特定区域，在阳性和阴性质控和内参检测体系的辅助下，从分子水平对钩端螺旋体进行核酸筛查或检测；

具体步骤如下：

1)根据钩端螺旋体LipL41基因序列设计LAMP反应特异性引物；

2)提取钩端螺旋体基因组DNA；

3)扩增LipL41基因片段构建重组质粒载体用于该LAMP反应的灵敏度分析；

4)分别以含LipL41基因的重组质粒DNA或钩端螺旋体基因组DNA为模板进行LAMP反应；

5)对LAMP反应的结果进行判定；

6)对LAMP反应产物进行酶切，根据酶切片段的大小确定反应产物的特异性。

2.根据权利要求1所述的一种钩端螺旋体的核酸检测方法，其特征在于所述的提取钩端螺旋体基因组DNA的步骤为：

1)10 000rpm离心5min收集培养的钩端螺旋体后加入500μl digestionbuffer和3μl的蛋白酶溶液，37℃温育30min；

2)向上述溶液中加入300μl CTAB/NaCl混匀，65℃作用10min；

3)加入等体积的平衡酚混匀后室温放置5min；

4)4℃10 000rpm离心5min，取上清并加入等体积的氯仿混匀后室温放置5min；

5)离心后取上清并加入1/3体积的NaAc和2倍体积的无水乙醇，-20℃放置1小时以上；

6)离心去除上清，将沉淀重悬于100μl的TE缓冲液中。

3.根据权利要求1所述的一种钩端螺旋体的核酸检测方法，其特征在于所述的扩增LipL41基因片段构建重组质粒载体用于该LAMP反应的灵敏度分析方法包括如下步骤：

1)通过PCR方法获得编码钩体主要外膜蛋白的LipL41的核苷酸序列片段；

2)将该片段与pGEM-T-easy载体连接，以构建重组质粒；

3)将连接产物转化大肠杆菌DH10B中，筛选阳性克隆并提取质粒DNA；

4)测定抽提质粒DNA的浓度并进行梯度稀释；

5)用稀释的质粒DNA作为模板，进行LAMP反应；

6)取小量反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳出现梯形条带所需模板DNA的量而确定该LAMP反应的灵敏度。

4.根据权利要求1所述的一种钩端螺旋体的核酸检测方法，其特征在于所述的分别以含LipL41基因的重组质粒DNA或钩端螺旋体基因组DNA为模板进行LAMP反应为：LipL41特异性引物混合液3μl、Bst polymerase 2μl和LipL41重组质粒或钩端螺旋体DNA1μl，加水至总体积为10μl，反应混合液在60-65℃反应30-60min，然后80℃放置2min以终止反应，各反应取2μl进行琼脂糖凝胶电泳。

5.根据权利要求1所述的一种钩端螺旋体的核酸检测方法，其特征在于所述的对LAMP反应结果进行判定的方法包括：1)：肉眼直接观察反应浊度，2)：DNA电泳，3)：实时浊度检测；在加入荧光染料后还可以通过4)：肉眼观察反应液颜色变化，5)：紫外照射下检测荧光，6)：实时检测荧光等上述6种方法中的一种或多种。

6.根据权利要求1所述的一种钩端螺旋体的核酸检测方法，其特征在于所述的对LAMP反应产物进行酶切，根据酶切片段的大小确定反应产物的特异性的方法为：在扩增目的片段的内部均有AluI酶切位点，将梯带状的LAMP扩增产物酶切为84bp和110bp的两个片段，通过AluI酶切鉴定该LAMP反应产物是否为特异性扩增。