[发明专利]含SOD基因的重组双表达家蚕多角体杆状病毒的构建方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及基因工程生产MnSOD的方法。具体地讲，本发明涉及含有SOD基因及多角体基因的重组双表达家蚕杆状病毒的构建方法。

背景技术

超氧化物歧化酶(SOD)能使人体内自由基保持在“自稳态”。超氧化物歧化酶清除超氧化物自由基，防止对机体直接或间接的损伤作用；SOD使O₂^·-成为细胞内自由基的排污漕；调节机体内O₂^·-的水平；调节机体内NO的水平；催化反应产物H₂O₂的作用(《自由基生物学的理论与应用》pp178-180)。

现在市售SOD多数为从哺乳动物牛、猪等的肝脏中提取，随着疯牛病、口啼疫、禽流感等流行，安全性有很大问题。家蚕重组病毒穿梭载体表达系统(Bac-to-Bac BaculovirusExpression System)是真核表达系统，该技术自1983年Smith等首创以来，已有千种外源基因在该系统表达(《昆虫病毒分子生物学》，1998，pp547-178)，由于有家蚕血淋巴本身的大量蛋白的保护作用和一些未知机理的作用，家蚕表达的蛋白质表达后修饰加工的方式与哺乳动物接近，能识别并正确地进行信号肽切除及磷酸化、糖基化、酰基化等作用，表达产物具有很高的生物活性，其抗原性、免疫原性和功能均与天然蛋白相似。

目前构建的重组杆状病毒大多是多角体缺失型病毒，这种病毒因为没有多角体包埋的病毒粒子，经家蚕中肠强碱性破坏而失活，因此不能经口添食感染，需逐个个体注射接种，并引起宿主死亡，使得每批生产时都要接种病毒，操作繁琐。注射接种就成为大规模、工业化生产的瓶颈。

添食感染可采取重组病毒喷散到桑叶上的方法感染家蚕，结合现阶段的养蚕技术，可实现规模化和工业化接种，操作简单，节省劳力和成本。

发明内容

为此本发明的目的是：采用家蚕杆状病毒穿梭载体表达系统，构建含有SOD基因及多角体基因的重组双表达杆状病毒，提供可以添食感染家蚕幼虫的病毒粒子。以期通过家蚕表达目的基因MnSOD，实现规模化和工业化生产。

本发明含MnSOD基因的重组双表达家蚕多角体杆状病毒的构建方法包括以下步骤：(1)以家蚕5龄第3天幼虫以RNA抽提试剂盒提取总RNA，设计MnSOD引物，正反向引物5’端分别引进EcoRI和KpnI酶切位点；

(2)以总RNA为模板，在通用引物oligo-dT₁₈和反向转录酶(Super script II reversetranscriptase)作用下合成单链cDNA；

(3)以单链cDNA为模板，在SOD正反向引物下PCR合成MnSOD基因，条件为94℃预变性5分钟，再以94℃1分钟，55℃1分钟，72℃2分钟，共35个循环，最后72℃延长10分钟；

(4)合成的MnSOD基因经乙醇沉淀和EcoRI和KpnI双酶切，电泳并切胶回收；将MnSOD基因与pFastBacHTa以连接试剂盒连接并转化XL-Blue细胞，挑斑在含每毫升100μg氨苄青霉素的LB培养基中培养繁殖，提取重组供体质粒pFastBacHTa/MnSOD；

(5)以家蚕杆状病毒DNA为模板，以多角体启动子5’端和多角体基因3’设计引物，通过PCR方法合成家蚕部分多角体基因，并将其克隆到pFastBac Dual plasmid质粒；

(6)以NcoI和KpnI限制性内切酶分别酶切pFastBacHTa/MnSOD和含部分多角体基因的双表达质粒，凝胶回收目的片段，将MnSOD基因插入双表达质粒的P10启动子下构建成双表达载体：Bm polyhedrin pFB dual/MnSOD；

(7)将Bm polyhedrin pFB dual/MnSOD转染到E.coli DH10Bac/BmNPV，37.5℃培养24～48小时，从中挑选容易分离、独立的白斑，在含有50μg/ml卡那霉素、7μg/ml庆大霉素、10μg/ml四环素的液体培养基上培养过夜，收集并提取含有MnSOD基因和多角体基因的双表达病毒DNA；

(8)将上述提取的DNA，在转染试剂脂质体(Cellfectin)介导下导入转染家蚕培养细胞，获得重组病毒。

步骤(1)所述Mn-SOD引物的序列为：

正向引物5’-atcgaattcATGTTAATGTCACAAAGGATTG-3’，