[发明专利]鳞翅目害虫基质金属蛋白酶基因mmp及其应用无效
申请号: | 200710164810.0 | 申请日: | 2007-12-24 |
公开(公告)号: | CN101210252A | 公开(公告)日: | 2008-07-02 |
发明(设计)人: | 陆建良;林晨;梁月荣;郑新强;杜颖颖 | 申请(专利权)人: | 浙江大学 |
主分类号: | C12N15/57 | 分类号: | C12N15/57;C12N9/64;C12Q1/68 |
代理公司: | 杭州中成专利事务所有限公司 | 代理人: | 金祺 |
地址: | 310027浙*** | 国省代码: | 浙江;33 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 鳞翅目 害虫 基质 金属 蛋白酶 基因 mmp 及其 应用 | ||
技术领域
本发明属于昆虫生物技术领域,具体的说涉及茶尺蠖基质金属蛋白酶基因的分离,以及利用该基因物调节鳞翅目害虫的变态反应。
背景技术
茶尺蠖等鳞翅目昆虫是重要的茶树害虫种类之一,对这些害虫的有效控制是茶叶高产优质的根本保证。但是随着现有农药使用频度和剂量的增加,鳞翅目害虫的抗药性逐渐增强,使防治效果下降。因此需要开发一些针对性强、作用位点明确、防效好的新农药。
基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,mmp)是生物降解细胞外基质成分的最主要蛋白水解系统,在组织重构中起重要作用。mmp是一类锌、钙依赖性的蛋白水解酶家族,是细胞外基质降解的主要酶类,MMPs在体内的表达、激活及对底物的分解都受到严格的调控。已有的研究显示,mmp的表达与活性与脊椎动物的免疫行为息息相关,它们在肿瘤细胞侵袭转移中起关键性作用,还与细胞的凋亡有关。但是现有对茶尺蠖等鳞翅目害虫的该基因及其产物的研究很少。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种鳞翅目害虫基质金属蛋白酶基因mmp及其编码的蛋白质,该基因物能用于调节鳞翅目害虫的变态反应。
为了解决上述技术问题,本发明提供一种鳞翅目害虫基质金属蛋白酶基因mmp,其具有SEQ ID No:1所示的核苷酸序列。
本发明还提供了上述基因mmp编码的蛋白质,其具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
本发明还提供了上述基因mmp的用途,利用该基因物调节鳞翅目害虫的变态反应。
作为本发明的基因mmp的用途的改进:将根据SEQ ID No:1所示的核苷酸序列设计的mmp siRNA注射入鳞翅目害虫体内,使内源mmp表达下调,达到鳞翅目害虫变态过程出现严重障碍。
作为本发明的基因mmp的用途的进一步改进:鳞翅目害虫为茶尺蠖。
本发明通过分子生物学技术手段分离和分析与鳞翅目害虫变态反应密切相关的基因,并明确这些基因的生理功能,提出鳞翅目害虫农药设计的新作用位点。本发明是采用cDNA-AFLP技术分离与鳞翅目害虫与变态反应有密切关系的基因mmp;所得的基质金属蛋白酶与鳞翅目害虫变态过程中基质水解的再利用相关。
实现本发明的具体技术步骤如下:
一、茶树鳞翅目害虫mmp基因片段分离和分析
取进食期(feeding stage)和休眠期(wandering stage)的茶尺蠖幼虫若干头。以TRIZOL(Invitrogen公司)试剂提取总RNA,并以UNIQ-10柱式mRNA抽提纯化试剂盒(上海生工生物工程有限公司)分离mRNA。分别取1-5μg mRNA进行cDNA合成,双链cDNA合成采用TakaRa MMLV RTase cDNA Synthesis Kit(宝生物工程[大连]有限公司)进行。双链cDNA经异丙醇沉淀纯化后,以TakaRa Afl II/Nsp I(宝生物工程[大连]有限公司)组合酶切消化。消化后的片段与事先设计的2个接头SEQ ID No:3和SEQ ID No:4,以T4 DNA连接酶(上海生工生物工程有限公司)连接。以连接完成的cDNA片段为模板,以预扩增引物SEQID No:5和SEQ ID No:6进行PCR预扩增,具体扩增条件见表1第1列,将预扩增产物适当稀释后,以选择性扩增引物组合SEQ ID No:7和SEQ ID No:8,以及SEQ ID No:9和SEQ IDNo:10,分别进行PCR选择性扩增,具体扩增条件见表1第2列。扩增产物以6%变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分析,以核酸银染试剂盒(上海生工生物工程有限公司)进行显带。
从凝胶上割取在进食期无表达、而在休眠区有强表达的对应条带。割取目标带,以纯水浸提过夜后,取适量浸提液作为模板,以选择性引物组合进行PCR,产物进行电泳。电泳结束后割取目标条带,以UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒(上海生工生物工程有限公司)进行片段回收,并插入pUCm-T载体(上海生工生物工程有限公司),阳性克隆委托Invitrogen公司进行序列分析,确定了其中一个726bp的显著差异序列与茶尺蠖变态密切相关的片断,其核苷酸顺序见SEQ ID No:1,经与美国生物信息数据库http://www.ncbi.nlm.nih.gov比对,证实该序列与果蝇、蜜蜂等基质金属蛋白酶具有很高同源性。因此定名为茶尺蠖mmp。并采用Editseq(DNAStar公司)软件进行推演,获得该核苷酸序列的氨基酸顺序,见SEQ ID No:2。
表1
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