[发明专利]利用多识别位点合成核酸分子的方法和组合物

权利要求书

1.一种分离的核酸分子，其包含：(a)一个或多个重组位点；和(b)一个或多个拓扑异构酶识别位点和/或一个或多个拓扑异构酶。

2.权利要求1的核酸分子，其中该核酸分子是一种环状分子。

3.权利要求1的核酸分子，其中该核酸分子包含两个或多个重组位点。

4.权利要求3的核酸分子，其中至少这两个或多个重组位点之一位于该分子中拓扑异构酶识别位点的每一末端的侧翼。

5.权利要求1的核酸分子，其中该重组位点选自：

(a)attB位点，

(b)attP位点，

(c)attL位点，

(d)attR位点，

(e)lox位点，

(f)psi位点，

(g)dif位点，

(h)cer位点，

(i)frt位点，

和保留重组能力的(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)或(i)的重组位点的突变体、变体和衍生物。

6.权利要求1的核酸分子，其中该拓扑异构酶识别位点由一种I型拓扑异构酶识别并结合。

7.权利要求6的核酸分子，其中该I型拓扑异构酶是一种IB型拓扑异构酶。

8.权利要求7的核酸分子，其中该IB型拓扑异构酶选自真核生物核I型拓扑异构酶和痘病毒拓扑异构酶。

9.权利要求8的核酸分子，其中该痘病毒拓扑异构酶由选自下列的病毒产生或从中分离：痘苗病毒、兔纤维瘤病毒、ORF病毒、禽痘病毒、触染性软疣病毒和桑缘灯蛾昆虫痘病毒。

10.一种包含权利要求1的核酸分子的载体。

11.权利要求10的载体，其中该载体是一种表达载体。

12.一种载体，其选自：pcDNAGW-DT(sc)、pENTR-DT(sc)、pcDNA-DEST41、pENTR/D-TOPO、pENTR/SD/D-TOPO、pcDNA3.2/V5/GWD-TOPO和pcDNA6.2/V5/GWD-TOPO。

13.一种包含权利要求1的分离的核酸分子的宿主细胞。

14.一种包含权利要求10的载体的宿主细胞。

15.一种包含权利要求12的载体的宿主细胞。

16.一种体外克隆核酸分子的方法，包括：

(a)获得待克隆的第一种核酸分子；

(b)将待体外克隆的第一种核酸分子与第二核酸分子混合，该第二种核酸分子包含侧翼为至少一个第一重组位点的至少一个第一拓扑异构酶识别位点，侧翼为至少一个第二重组位点的至少一个第二拓扑异构酶识别位点，其中第一和第二重组位点彼此不重组，以及至少一种拓扑异构酶；和

(c)在能使待克隆的第一种核酸分子插入该第二种核酸分子的第一与第二拓扑异构酶识别位点之间的条件下，温育该混合物，从而产生在第一与第二重组位点之间包含待克隆的第一种核酸分子的第一种产物分子。

17.权利要求16的方法，其中该第二种核酸分子是一种载体。

18.权利要求16的方法，其中将要克隆的该第一种核酸分子是一种线性核酸分子。

19.权利要求18的方法，其中该线性核酸分子是一种平端核酸分子。

20.权利要求16的方法，其中将要克隆的该第一种核酸分子是一种PCR产物。

21.权利要求16的方法，其中将要克隆的该第一种核酸分子包含至少一个开放阅读框。

22.权利要求16的方法，其进一步包括：在有利于在第一与第三和第二与第四重组位点之间重组的条件下，将该第一种产物分子与至少一种第三种核酸分子接触，后者包含彼此不重组的至少一种第三和第四重组位点。

23.权利要求22的方法，其中第三种核酸分子是一种载体。

24.权利要求16的方法，其进一步包括向一种宿主细胞中插入该第一种产物分子。