[发明专利]含有病毒的组合物以及浓缩病毒制剂的方法

说明书

本申请是国际申请日为1999年2月12日、国际申请号为PCT/US99/01873(国家申请号为99805098.9)、发明名称为“含有病毒的组合物以及浓缩病毒制剂的方法”的申请的分案申请。

I.技术领域

本发明涉及含有病毒尤其是病毒载体、稳定性明显提高的组合物。本发明的组合物可用于保持病毒在保藏期间稳定性，本发明的含病毒组合物尤其可用于治疗用途如基因治疗。本发明还提供了浓缩以及纯化病毒制剂的新方法。

II.背景技术

病毒对于治疗用途如疫苗接种和基因治疗愈来愈重要，需要开发和制备易于保藏和运输而仍然保持足够安全性和功效的、稳定的含病毒组合物。具体地说，已知在基因治疗中广泛使用病毒载体，重要的是开发和制备能够稳定地保存携带有治疗转基因的活重组病毒配方(formulation)。

此外，极其需要能够在-80℃以上、长时间内能够稳定病毒制剂的配方。含病毒组合物通常需要贮藏于-80℃而不能够在标准冷藏温度(例如2℃-8℃或更高)贮藏足够长的时间。这种限制不仅对贮藏是一个严重的障碍，而且对生产、分销和广泛的临床使用也是一个严重的障碍。

也需要开发即使暴露于冷藏温度和经受苛刻的条件下，如冻/融尤其是与大规模生产、装卸或分销中可能发生的慢速冻/融时，仍然能够在长时间内保持pH范围约7-约8.5的含病毒组合物。因为在pH低于7.0及高于8.5时活病毒粒因物理和生物不稳定性而易于丧失活力，所以维持pH对病毒制剂是重要的。

另外的问题是涉及增加病毒浓度的问题。尤其是高病毒浓度是病毒不稳定性的主要原因。然而，临床应用需要渐增的高浓度病毒和病毒载体。所以，极其需要开发尤其是在上述苛刻条件下稳定的较高浓度病毒的配方。此外，特别需要开发浓缩现有病毒制剂的新方法，以实现高浓度水平的稳定制剂。如果人们试图浓缩现有病毒制剂，则显著加重与高病毒浓度有关的不稳定性问题。其部分原因是在努力增加现有病毒制剂浓度的过程中会承受另外的机械剪切力所致。如果人们能够找到浓缩病毒制剂而不会明显损害病毒稳定性的方法，则能够容易地制备任何需要浓度的临床剂量(即使使用较低浓度原料开始时)，而且更重要的是，浓缩病毒的能力能够解决瓶颈问题以及通过使在各种加工如尺寸排阻色谱法的步骤中的物料通过量明显增加，从而解决纯化过程中的其它放大问题。

因此需要完成上述目的的材料和方法。

III.发明内容

本发明通过提供在含有多羟基烃、在约2℃-27℃温度范围内将pH缓冲维持于约7-约8.5范围的配方中含有病毒的稳定组合物，从而满足上述需要。

还提供浓缩现有病毒制剂的新方法，该方法使得人们易于选择和制备宽范围的需要浓度的临床剂量。浓缩病毒制剂的优选方法包括：

(a)向病毒制剂中加入多羟基烃至多羟基烃终浓度约为20％或以上；以及

(b)使所述病毒制剂经受一个过滤过程，其中对所述制剂施加压力，以致通过滤器从病毒制剂去除稀释剂而同时保留病毒，从而增加病毒浓度。

本发明还提供浓缩病毒制剂的方法，包括：

(a)离心包括如下层的组合物：包含35％-80％(v/v)浓度的多羟基烃的第一层，所述第一层上覆盖含有5％-30％(v/v)浓度的多羟基烃的第二层，第二层上覆盖含有病毒的第三层；和

(b)从第一层回收病毒。

而且，本发明人发现其提高病毒浓度的新方法还具有进一步提高加工效率的优势(例如通过使在各种加工如尺寸排阻色谱法的步骤中的物料通过量明显增加从而减少或消除后续纯化过程中的瓶颈问题)。所以，在优选的实施方案中，按照本发明浓缩病毒制剂的方法进一步包括后续纯化步骤(例如尺寸排阻色谱法)。在这一方面，当在离子交换色谱法后进行尺寸排阻色谱法步骤时，本发明的方法特别有用，并且在离子交换色谱法之后但是在尺寸排阻色谱法之前(按照本发明)浓缩病毒制剂。例如由阴离子交换色谱法获得的病毒流分通常含有高浓度盐和在浓缩过程中进一步损害病毒稳定性的其它可能杂质。因此，在特别优选的实施方案中，本发明提供纯化病毒制剂的方法，包括：

(a)使病毒制剂经过阴离子交换色谱法，其中从阴离子交换色谱法的介质中洗脱作为病毒制剂产品的病毒；

(b)向步骤(a)病毒制剂产品中加入多羟基烃，使制剂中的多羟基烃浓度达到最终浓度约为25％或以上；以及

(c)通过对所述制剂施用压力以通过滤器从病毒制剂中去除稀释剂而保留病毒，从而提高步骤(b)病毒制剂产品中的病毒的浓度；和

(d)再使步骤(c)的浓缩病毒制剂产品经过一次或多次另外的加工步骤。