[发明专利]hmgr和fps共转化提高青蒿中青蒿素含量的方法

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种生物技术领域的提高青蒿素含量的方法，特别是一种双关键酶基因hmgr和fps共转化提高青蒿中青蒿素含量的方法。

背景技术

青蒿(Artemisia annua L.)是菊科蒿属的一年生草本植物。青蒿素(artemisinin)是从其地上部分分离的一种含有过氧桥结构的倍半萜内酯化合物，是目前世界上公认的最有效的治疗疟疾的药物，特别是对于脑型疟疾和抗氯喹疟疾具有速效和低毒的特点。目前，世界卫生组织推荐的最有效的治疗疟疾的方法就是青蒿素联合疗法(Artemisinin-based combination therapies，ACTs)。另外，随着对青蒿素药理研究的逐步深入，科学家发现青蒿素及其衍生物还具有抗炎、抗血吸虫、抗肿瘤以及免疫调节的功能。可见青蒿素是一种极具潜力的天然药物。

目前青蒿素的主要来源是从青蒿植株的地上部分提取，然而青蒿中青蒿素的含量非常低(0.01％-1％)，使得这种药物的大规模商业化生产受到了限制。由于青蒿素结构复杂，人工合成难度大，产量低，成本高，不具有可行性。有人尝试用组织培养和细胞工程的方法来生产青蒿素，然而青蒿素在愈伤组织中含量低于干重的0.1％，在芽中最高也只有干重的0.16％，而大多数研究在根中没有检测到青蒿素。因此利用组织培养及细胞工程来生产青蒿素的可行性也不高。

经对现有技术文献检索发现，Dahua Chen等在《Plant Science》(《植物科学》，2000年155期179-185页)发表了题为“Expression of a chimericfarnesyl diphosphate synthase gene in Artemisia annua L.transgenic plantsvia Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation”(“通过农杆菌介导转化在青蒿植株中表达法尼基焦磷酸合酶基因”)的论文，报道通过过量表达法尼基焦磷酸合酶(farnesyl diphosphate synthase，FPS)，使转基因青蒿中青蒿素的含量提高了2-3倍，但仍然只有1％左右。不过，代谢工程为提高青蒿中青蒿素的含量提供了一条可行的方法。

现有技术中 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl CoA reductase，HMGR)和法尼基焦磷酸合成酶(farnesyl diphosphate synthase，FPS)是法尼基焦磷酸合成途径中的关键酶，而法尼基焦磷酸是青蒿素合成的前体。采用基因工程手段，用关键酶基因hmgr和fps共转化青蒿，将增加法尼基焦磷酸的合成速度，为青蒿素的生物合成提供更多的前体，从而获得青蒿素高产的青蒿植株，为规模化生产青蒿素提供一条新途径。尚未发现与本发明主题所提及的hmgr和fps共转化提高青蒿中青蒿素含量的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种hmgr和fps共转化提高青蒿中青蒿素含量的方法。本发明涉及的关键酶基因克隆、载体构建、遗传转化、分子检测、青蒿素提取及含量测定用于本发明，建立了稳定提高青蒿中青蒿素含量的方法，为利用转基因青蒿大规模生产青蒿素奠定坚实的基础。

本发明是通过以下技术方案实现的：本发明从青蒿中克隆hmgr和fps基因，构建含所述DNA分子的植物表达载体，用根癌农杆菌介导，将hmgr和fps基因同时导入青蒿并再生出植株；PCR检测外源目的基因hmgr和fps的整合情况，高效液相色谱-蒸发光散射检测器(HPLC-ELSD)测定青蒿中青蒿素含量，筛选获得青蒿素含量显著提高的转基因青蒿植株。

本发明包括如下具体步骤：

(1)采用基因克隆方法获得青蒿关键酶基因hmgr和fps；

(2)把hmgr和fps基因可操作性地连接于表达调控序列，形成含hmgr和fps基因的植物表达载体；

(3)将含hmgr和fps基因的植物表达载体转化根癌农杆菌(为市场有公开出售的生物材料，可以从多家公司如澳大利亚CAMBIA公司购得)，获得用于转化青蒿的含hmgr和fps基因植物表达载体的根癌农杆菌菌株；

(4)利用所构建的根癌农杆菌菌株转化青蒿，获得经PCR检测的转基因青蒿植株；

(5)对获得的转基因青蒿中青蒿素含量进行HPLC-ELSD测定，筛选获得青蒿素含量显著提高的转基因青蒿植株。