[发明专利]新型细菌表面展示系统、方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，更具体地，涉及细菌表面展示技术领域，特别是指一种新型细菌表面展示系统、方法及应用。

背景技术

细胞表面定位分子在自然界中普遍存在，其表面定位过程由不同的细胞表面蛋白调控，并形成了很多生物学现象，比如细胞间的识别，信号转导，表面吸附，定殖，免疫反应等等。研究人员利用这些表面蛋白作为锚定元件将外源的多肽和蛋白与其融合，将其展示到细菌或病毒的表面从而达到一定的研究和应用目的。将外源蛋白定位表达在细菌表面后，可以直接用重组微生物进行后续实验操作，免去了目标蛋白的产物提取，纯化等一系列操作，而且如果展示的是抗原蛋白，由于抗原暴露在细胞表面，所以更有利于免疫系统的识别，而且外膜上的脂多糖等因子可以增强免疫反应，还可能作为锚定在细胞表面的目标蛋白的辅助因子而发挥作用(Lee J.S.，Shin K.S.，PanJ.G.，and Kim C.J.2000.Surface-displayed viral antigens on Salmonella carrier vaccine.Nat.Biotechnol.18：645-648)。第一篇关于将外源多肽或蛋白利用遗传学方法融合到载体蛋白上，从而成功将它们展示的报道是在1986年分别由Freudl等(Freudl R.，MacIntyre S.，Degen M.，Henning U.，1986.Cell surface exposure of the outer membraneprotein OmpA of Escherichia coli K-12.J.Mol.Biol.188，491-494)以及Charbit等(Charbit A.，Boulain J.C.，Ryter A.，Hofnung M.1986.Probing the topology of abacterial membrane protein by genetic insertion of a foreign epitope；expression at the cellsurface.EMBO J.5，3029-3037)完成的。之后，许多不同的细菌表面展示系统被研究和开发出来，使得表面展示技术得到迅速的发展。

在所有被开发和研究的表面展示系统中，应用最广泛的一个系统是Lpp-OmpA系统，它是Georgiou和他的合作者在1992年构建的，他们利用Lpp-OmpA融合子成功的将β-内酰胺酶展示到大肠杆菌表面(Francisco J.A.，Earhart C.F.，Georgiou G.1992.Transport and anchoring of beta-lactamase to the external surface of Escherichia coli.Proc Natl Acad Sci USA 89(7)：2713-7)，该系统由两部分组成：1)E.coli主要外膜脂蛋白Lpp信号肽以及N端的九个氨基酸；2)E.coli外膜蛋白OmpA的46-159位氨基酸(包含跨膜区B3-B7)，外源蛋白与此系统的C末端融合。之后，研究者利用该系统展示了许多外源蛋白，使得该系统在生物催化，抗体制备，固定化细胞，生物传感器制备等方面都有应用。由于该系统避免了夹心法融合外源蛋白进行表面展示对外源蛋白的诸多限制，使得以E.coli为宿主用该系统进行展示的外源蛋白的大小达到了70kDa(Wan H.M.，Chang B.Y.，Lin S.C.2002.Anchorage of cyclodextringlucanotransferase on the outer membrane of Escherichia coli. Biotechnol Bioeng79(4)：457-64)。利用该系统进行表面展示还有很多优点，比如，Lpp-OmpA系统具有高效的分泌信号肽和独特的跨膜结构，并提供了适宜的目标蛋白融合位点，而且其坚固的锚定结构能够准确的将外源蛋白定位在细胞表面。

鳗弧菌是一种重要的鱼类细菌性病原，可以在全世界范围内引起海水鱼和淡水鱼的流行性疾病，对鱼类养殖造成很大的损失。在鳗弧菌强毒株MVM425基础上通过DNA重组技术构建的鳗弧菌减毒株MVAV6203(保藏号为CCTCC NO：M204066，保藏日为2004年9月15日，具体请参见中国专利ZL200410089496.0，申请日为2004年12月14日)，该减毒株毒力减弱了10000倍，对靶标和非靶标动物安全无毒，并对弧菌病具有较高的免疫保护力，是一株优秀的减毒活菌疫苗候选株。