[发明专利]用于原子力显微镜观察的石蜡切片脱蜡方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物工程技术领域的石蜡切片制样方法，具体是一种用于原子力显微镜观察的石蜡切片脱蜡方法。

背景技术

石蜡切片技术是细胞生物学最常用的技术之一，包括固定、脱水、包埋、切片、脱蜡、染色等几个主要步骤，常用于在光学显微镜下作组织和细胞的形态学检测。石蜡切片染色之前需要完全脱蜡，以便染色剂着色(见郑国铝，谷祝平著：生物显微技术，第二版，北京：高等教育出版社，1993)。常用的脱蜡试剂是二甲苯，处理时间根据样品材料的不同和实验条件等因素不同而有差异，一般是15～60min。但是当石蜡切片用原子力显微镜(AFM)来观察时，在脱蜡之前切片表面不能清晰显示组织和细胞结构，而完全脱蜡后部分表面已被破坏，且粗糙度太大，因此必须发展适合原子力显微镜观察的石蜡切片脱蜡方法。

经对现有技术的文献检索发现，荣玮等在《解剖学杂志》上(2006，29(1)P.92)上发表的“关于石蜡切片在染色中脱蜡的探讨”中提出加热二甲苯或者烘烤切片以加快脱蜡的方法，邓昂在《华中医学杂志》上(2002，26(5)P.262)发表的“病理切片中松节油代替二甲苯脱蜡”中提出了用松节油来代替常用的二甲苯对石蜡切片进行脱蜡，有助减轻二甲苯对操作人员的毒性。上述这些方法都是对现有石蜡切片脱蜡方法的改善，以更好的适应光学显微镜的观察。但目前尚无针对原子力显微镜观察的石蜡切片脱蜡方法的报道，因此非常有必要发展适合于原子力显微镜观察的石蜡切片样品制备技术，尤其是切片脱蜡技术。

发明内容

本发明针对现有技术的上述不足，提供一种用于原子力显微镜观察的石蜡切片脱蜡方法，使其具备步骤简单，操作简便，所得的切片表面粗糙度合适，能够展现组织和细胞的精细结构，适合于原子力显微镜观察。

本发明是通过以下技术方案实现的，本发明包括如下步骤：

第一步，按体积比为1∶1的比例将二甲苯和无水乙醇混匀，注满两个染色缸，将贴附于载玻片表面的石蜡切片全浸入第一个装满二甲苯和无水乙醇混合液的染色缸中处理1min，其间轻轻摇动一次。

第二步，将第一个染色缸中的石蜡切片取出，立即浸入装满二甲苯的染色缸中，在室温25℃的条件下处理15min～30min。其间每隔5min轻轻摇动染色缸一次。

第三步，将切片取出，立即浸入第二个装满二甲苯和无水乙醇混合液的染色缸中处理2min，其间轻轻摇动一次。

第四步，将切片取出，立即浸入装满无水乙醇的染色缸中处理2min，取出晾干，即获得适合于原子力显微镜观察的石蜡切片。

在上述发明中，石蜡切片经过二甲苯的脱蜡处理，组织和细胞的精细结构已暴露出来，可以供原子力显微镜观察和形态分析，分辨率在亚细胞的水平，能够分辨细胞膜、细胞核以及胞内基质，还包括细胞间质和胞外基质。尤其细胞核形态完整，且凸出于细胞基质，在原子力显微镜下易于分辨和识别。本方法步骤简单，操作方便。

附图说明

图1为不同脱蜡时间的石蜡切片在原子力显微镜空气中观察的图像

其中：A是未经脱蜡的石蜡切片样品，B是本发明实施例1中制备的样品，切片脱蜡时间为15min，C是脱蜡时间为65min的样品。

图2为本发明实施例2中制备的样品在原子力显微镜空气中观察的图像。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1

将贴附在载玻片表面的石蜡切片浸入体积比为1∶1的二甲苯和无水乙醇混合液中处理1min，立即转入二甲苯中处理15min，其间轻轻摇晃两次。到时间后，再转入体积比为1∶1的二甲苯和无水乙醇混合液中处理2min，最后转入无水乙醇中处理2min，取出晾干，供原子力显微镜观察。

将上述方法脱蜡的石蜡切片在原子力显微镜下观察，所得图像见图1A，可见切片表面粗糙度合适，细胞轮廓清晰，胞内有凸出的细胞核，细胞间有基质。扫描范围：50μm×50μm。如果是未经脱蜡处理的石蜡切片直接用原子力显微镜观察，因为表面被一层石蜡覆盖，不能显示组织和细胞的结构，见图1B。如果是脱蜡时间在60min以上，切片将被完全脱蜡，则表面结构已被部分破坏，粗糙度很大，难以观察到组织和细胞的精细结构，见图1C。

实施例2