[发明专利]一种φC31位点特异重组酶突变体、其制备方法及应用

说明书

技术领域

本发明属于遗传工程领域，具体涉及一种位点特异重组酶、其制备方法及应用。

背景技术

ΦC31整合酶，属于丝氨酸重组酶家族，基因组大小约2.1Kb，开放阅读框编码613个氨基酸，分子量约67Kda。ΦC31整合酶可识别细菌基因组上至少由34bp组成的特异附着点(attB)和嗜菌体基因组上至少由39bp组成的特异附着点(attP)，并在不加辅助因子下能介导attB和attP之间的DNA重组。研究发现，在被attP位点修饰的小鼠及人细胞系，ΦC31整合酶介导的位点特异整合效率比随机整合的自发性背景的效率高10-20倍以上；比基于同源重组原理的基因打靶效率高2-3个数量级；比Cre重组酶介导的位点特异整合效率高10-100倍。尤其是发现在哺乳动物细胞基因组上存在有内源性attP类似位点(pseudo attP sites，称假attP位点)；ΦC31整合酶可将携带有attB位点的大片段外源基因稳定整合到假attP位点，其位点特异整合效率比随机整合效率高5-10倍以上，且90％的整合事件发生在假attP位点。重要的是在已发现的假attP位点附近不存在功能基因，不发生基因沉默(gene silence)现象。因而，ΦC31整合酶系统已初步成为基因功能分析尤其是基因治疗研究的有效的工具。

然而，ΦC31整合酶系统仍存在着在哺乳细胞上介导位点特异整合效率远低于原核细胞以及在哺乳细胞染色体上可识别多个假位点等有待于解决的基础问题。因此，为了使ΦC31整合酶系统成为哺乳细胞遗传操作更有效的工具，就必须提高其整合位点特异性以及整合效率。

发明内容

本发明目的之一是提供一种高效特异的位点特异性重组酶。

本发明目的之二是提供上述位点特异性重组酶的制备方法。

本发明提供了一种ΦC31位点特异重组酶突变体，所述的突变包括将第285位缬氨酸V突变为丙氨酸A。

本发明提供了一种ΦC31位点特异重组酶突变体，即将ΦC31位点特异重组酶第285位缬氨酸V突变为丙氨酸A。

野生型ΦC31位点特异整合酶基因ΦC31(其NCBI登陆号AX816372)。编码ΦC31位点特异重组酶质粒CMV int，突变体的克隆载体pINT-T，来源于美国Carlos博士实验室惠赠，来源于文章：Groth AC，Olivares EC，Thyagarajan B，Calos MP.A phage integrase directs efficient site-specific integrationin human cells.Proc Natl Acad Sci USA 2000，97：5995-6000；SclimentiCR，Thyagarajan B，Calos MP.Directed evolution of a recombinase forimproved genomic integration at a native human sequence.Nucleic AcidsRes.2001，15：29(24)：5044-51。

本发明还提供了上述突变体的制备方法，采用定向突变方法将野生型ΦC31位点特异整合酶285位缬氨酸V突变为丙氨酸A。

本发明的突变体也可以通过下列方法获得：以小鼠MpsL1(NCBI登录号为AC079573，取其中的15361-15579)位点为靶点，以野生型ΦC31整合酶为基础，利用易错PCR(error prone PCR)和DNA Shuffling方法对其进行突变和重排，然后将改组的ΦC31整合酶连接到表达载体中，构建ΦC31整合酶突变体库。经过筛选得到选择标记的克隆；再以此为基础，经过多轮DNA Shuffling和筛选，通过在原核和真核细胞系上整合效率和整合特异性分析，鉴定出更高整合特异性和更高整合效率的ΦC31整合酶突变体。

本发明还提供了上述突变体的应用，即将该ΦC31位点特异重组酶突变体应用于基因功能鉴定。

本发明的ΦC31位点特异重组酶突变体还可以应用于基因定点导入。

本发明中，所应用的宿主细胞可以是分裂或者非分裂细胞。

本发明中，所应用的非分裂细胞是神经元细胞、胶质细胞或者干细胞。