[发明专利]一种基于硝酸纤维素膜的植酸酶高通量筛选体系

权利要求书

1.一种基于硝酸纤维素膜的植酸酶高通量筛选体系，包括下列步骤：

(1)获得植酸酶U 59804突变基因：通过引物U 59804Z1：aaggatccatggtgactctgactttcctgc tttcg和U 59804 F1：tgaactaaagcactctccccag从烟熏曲霉cDNA中扩增得到植酸酶U 59804 基因，回收的植酸酶基因的DNA片段用DNA酶进行降解，回收的降解产物进行无引物 PCR扩增，再以无引物扩增产物为模板加入引物U59804Z1和U 59804F1，进行PCR 扩增获得植酸酶U 59804突变基因；

(2)上述获得的植酸酶U 59804突变基因，经BamHI和SacI双酶切后，植入含氨苄 青霉素抗性基因的载体pYPX 251中，获得带庆大霉素抗性基因原核启动子及t1t2终止 子的植酸酶U 59804突变基因原核表达载体质粒，再经电击将质粒转入宿主菌大肠杆菌 DH5α中，在氨苄青霉素的固体培养基上培养得转化子；

(3)上述长出的U 59804突变基因的大肠杆菌转化子，影印至硝酸纤维素膜上，以 植酸钾为底物进行高通量筛选；

(4)用钼蓝法测定植酸酶酶活性；

其中，所述的高通量筛选试验方法为：将37℃培养过夜的含有植酸酶U 59804突变 基因的大肠杆菌转化子培养皿正面朝上放置于超净台上；打开培养皿，用镊子将硝酸纤 维素膜放置于大肠杆菌转化子上；用镊子轻轻压，使硝酸纤维素膜被菌落浸湿；用镊子 夹住被菌落浸湿硝酸纤维素膜的一角，轻轻掀起硝酸纤维素膜；超净台风机风干含有菌 落的湿硝酸纤维素膜；含有菌落的湿硝酸纤维素膜菌落朝上放置于含有1％植酸钾或者 植酸钠溶液的滤纸上反应30分钟；再将含有菌落的湿硝酸纤维素膜菌落朝上放置于含 有1.5g/100ml钼酸铵、3％硫酸、7.3g/100ml硫酸亚铁的显色液中显色。

2.根据权利要求1所述的硝酸纤维素膜的植酸酶高通量筛选体系，其特征在于，所述 转化子带有庆大霉素抗性基因原核启动子及t1t2终止子的原核表达载体质粒。

3.权利要求1所述的基于硝酸纤维素膜的植酸酶高通量筛选体系在植酸酶改造中进行 高通量筛选体系中的应用。