[发明专利]一种稳定的酶法测定唾液酸液体双试剂及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种双试剂，具体涉及一种酶法测定唾液酸液体双试剂及其 应用。

背景技术

唾液酸又称N-乙酰神经氨酸(Sialic Acid，sA)，是细胞膜糖蛋白的重要组 成部分，以与细胞膜糖蛋白、糖脂结合两种形式存在。唾液酸与生物体的许多生 物学功能有关，当细胞代谢异常时，唾液酸脱落进入体液，以致血中唾液酸升高。 测定血清唾液酸浓度，可作为癌肿诊断辅助性指标和疗效观察指标，癌症患者SA 水平动态变化与病情相关，可以用于早期发现肿瘤的转移和复发，对肝硬化的诊 断及预后判断有重要意义，SA升高也是心血管疾病的危险因素之一，近年来SA 含量与疾病的关系研究更涉及到糖尿病肾病等临床诊断应用中。除此之外，SA含 量检测也可应用在食品安全和健康领域，如燕窝、奶粉中的唾液酸含量检测。

唾液酸的检测方法主要有HPLC、酶法、化学比色法(常见的硫代巴比妥酸法、 间苯二酚法)。HPLC法具有灵敏度高、特异性好，但仪器昂贵且不适合临床批量 检测，化学比色法虽然价格低廉，但特异性较低、操作复杂，需高温萃取，不适 合自动化分析，其试剂成分具有一定的腐蚀性及对人体的危害性。酶分析法具有 特异性高、操作简单快捷、准确安全，可自动化分析，酶法中最常用的是偶联乳 酸脱氢酶的紫外法，由于以往自动化分析仪未普及试剂用量大、干粉试剂复溶后 稳定时间短、适用机型少，用户使用成本高、无法满足临床检测需求。

发明内容

本发明的目的在于：

(1)提供一种稳定的酶法测定唾液酸液体双试剂；

(2)提供一种稳定的酶法测定唾液酸液体双试剂在制备肿瘤筛查 或唾液酸检测试剂中应用。

本发明的目的是通过以下技术方法来实现的：本发明人经过对试剂的 主要成分：神经氨酸苷酶、N-乙酰神经氨酸醛缩酶、还原型辅酶NADH特 性进行仔细研究发现(见图1、2，唾液酸测定试剂中几个重要成份的特性)， 进口的干粉单一试剂成本过高原因，主要是单一试剂的系统设计无法满足 上述反应成分的最佳条件，主要表现在：1、本反应的关键工具酶神经氨 酸苷酶在其反应条件下活性只有最佳状态的50％活性左右，由于神经氨酸 苷酶价格十分昂贵，致使试剂成本过高；2、还原型辅酶NADH在其反应条 件下不稳定，必须制成干粉试剂才能达到长期保存稳定，复溶后须尽快使 用，否则在保存过程中NADH降解很快对试剂性能造成影响，由于进口干 粉单一试剂都是大包装，中小用户使用复溶后如不及时用完，造成试剂浪 费增加成本。

本发明的技术方案如下：一种稳定的酶法测定唾液酸液体双试剂，由 试剂1和试剂2组成，试剂1包括：

神经氨酸苷酶   0.01-50KU/L

乳酸脱氢酶     0.1-50KU/L

缓冲液         25-100mmol/L

试剂2包括：

N-乙酰神经氨酸醛缩酶  0.1-50KU/L

还原型辅酶NADH        0.05-5mmol/L

葡萄糖脱氢酶          0.1-10000 U/L

葡萄糖                0.1-500mmol/L

缓冲液                25-100mmol/L

所述的缓冲液选自Tris类缓冲液、磷酸盐缓冲液、焦磷酸盐缓冲液、甘氨酸 缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、二乙醇胺、三乙醇胺类缓冲液、碳酸盐缓冲液、MES缓 冲液、Good′s缓冲液或硼酸类缓冲液，其PH值在3.0至11.0，试剂1、试剂2 中还包括稳定剂、表面活性剂、防腐剂，所述的稳定剂选自Mg离子、NaCl、KCl、 CaCl₂、牛血清白蛋白、人血清白蛋白、抗生素、鳌合剂EDTA类、聚乙二醇、二 糖类、多元醇、双甘肽及抗氧化剂，抗生素选自：氯霉素、红霉素、青霉素、庆 大霉素，二糖类选自：山梨醇、甘露醇、蔗糖、海藻糖，多元醇选自：乙二醇、 丙三醇、丙二醇，表面活性剂选自：Tween系列、Triton X-100等非离子表面 活性剂，防腐剂选自：庆大霉素、麝香草酚、羟基苯甲酸、氮化钠等。

一种稳定的酶法测定唾液酸液体双试剂，由试剂1和试剂2组成，

试剂1包括：

MES缓冲液pH6.2        100mmol/L

神经氨酸苷酶          240U/L