[发明专利]白细胞介素23-白细胞介素6融合蛋白及制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种白细胞介素23(IL-23)—白细胞介素6(IL-6)的融合蛋白，提供一种生物技术来制备白细胞介素23—白细胞介素6融合蛋白的方法。

背景技术

以往研究表明：IL-23是由p19和IL-12的p40亚单位通过二硫键相连组成的异二聚体。由活化的树突状细胞(DC)和巨噬细胞()产生，它能促进DC对肿瘤抗原肽的提呈，能影响T细胞的增殖，并且除了直接作用于T细胞外，IL-23还能通过DC来活化和调节T细胞依赖的免疫应答。另外，IL-23具有较强的抗肿瘤作用，IL-23因其所诱导的IFN-γ的产生较少及对APC的激活作用将有望成为肿瘤治疗中一种新的、更为安全的选择。IL-6是一具有明显抗肿瘤活性的生物免疫调节剂，属参与造血、免疫的多功能因子，其特点是抗肿瘤活性高，毒性作用小。新近研究证实，IL-6可直接作用于NK细胞，并促进其功能分化。

发明内容

本发明目的是提供一种白细胞介素23(IL-23)—白细胞介素6(IL-6)的融合蛋白，提供一种生物技术制备白细胞介素23—白细胞介素6融合蛋白的方法。

本发明的目的是通过下述方法实现的：我们以IL-23功能区特异性的上下游引物，通过RT-PCR合成包含信号肽序列及BamHI-EcoRI两个酶切位点的IL-23cDNA，同理以IL-6功能区特异性的上下游引物合成无信号肽序列的包含XhoI-XbaI两个酶切位点及终止密码子TGA的IL-6cDNA。经过纯化酶切，连接重组至表达载体pcDNA3.1(+)。将该pcDNA3.1(+)/IL-23-IL-6重组质粒转染至中国仓鼠卵巢细胞(CHO)进行表达，表达产物即为IL-23-IL-6融合蛋白。

IL-23-IL-6融合蛋白较IL-23、IL-6单因子或双因子联合都有更多的生物学效应，达到了很好的协同效应。

具体实施方式

以下对本发明作详细说明：

一、引物合成：利用Sequce程序通过计算机分析确定转译的最佳起始区域，使其具有最小自由能，最佳碱基排列，确保两个引物之间，引物与模板之间具有最少的配对以避免扩增不必要的序列。在IL-23上游引物中导入BamHI酶切位点，接着为起始密码子ATG及信号肽序列；在下游引物中导入EcoRI酶切位点。在IL-6上游引物中导入XhoI酶切位点；下游引物中导入终止密码子TGA及XbaI酶切位点。

二、基因克隆：通过RT-PCR合成包含信号肽序列及BamHI-EcoRI两个酶切位点的IL-23cDNA，同理以IL-6功能区特异性的上下游引物合成无信号肽序列的包含XhoI-XbaI两个酶切位点及终止密码子TGA的IL-6cDNA，经过纯化，再以T-A克隆进行扩增，最后将该IL-23cDNA与IL-6cDNA分别克隆入pcDNA3.1(+)表达载体，以BamHI-EcoRI和XhoI-XbaI双酶切鉴定及测序分析。

三、真核细胞表达：将上述阳性克隆转染CHO细胞表达，收集表达上清，以ELISA检测IL-23与IL-6的表达。

四、纯化及活性鉴定：对表达上清进行蛋白纯化，纯化后的蛋白进行淋巴细胞增殖试验，证实该表达产物可明显增强淋巴细胞增殖，且比单独的II-23与IL-6效果更为明显。