[发明专利]乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前S区化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及免疫分析医学领域，具体地，本发明提供了一种乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白前S区测定试剂盒及其制备方法，结合了生物素—亲和素免疫放大技术和化学发光免疫分析技术。

背景技术

乙型肝炎病毒属嗜肝病毒家族，可引起急性肝炎、慢性肝炎和肝硬化，而且和肝癌的发生密切相关。中国是乙型肝炎的高流行区，但目前尚无有效的抗病毒方法治疗乙型肝炎病毒慢性感染，因此病毒的预防和检测就是避免感染的重要手段，对病毒感染的动态监测也能为乙肝的发展、预后提供重要的信息。

乙肝病毒表面抗原是乙型肝炎病毒的外膜蛋白，由乙型肝炎病毒基因组的S区所编码。乙型肝炎病毒表面抗原依靠三个启动子进行表达后，产物分别为大蛋白(LHBs，包括前S1，前S2和S)；中蛋白(MHBs，包括前S2和S)；小蛋白(SHBs，包括S)，我们通常检测的乙肝表面抗原实际指的是小蛋白(SHBs)。

乙型肝炎病毒可以分泌三种病毒颗粒：小球形颗粒(直径约22nm)，主要由MHBs和SHBs组成，管状颗粒(直径约22nm，长度约100-1000nm)，由LHBs，MHBs和SHBs组成；Dane颗粒，其外膜结构蛋白组成与管状颗粒一致，Dane颗粒包含有乙型肝炎病毒DNA。完整病毒颗粒外膜的组成依赖于LHBs，MHBs和SHBs三种蛋白的共同作用，而在LHBs缺失的情况下，后两者只能形成小球形颗粒，因此LHBs的表达实际上起着调节病毒外膜组装能力的作用。只有当LHBs蛋白表达达到一定的量时，病毒颗粒才能以有包膜的形式(包括管状颗粒和Dane颗粒)被释放。因此，检测LHBs，实际反应的是体内管状颗粒和Dane颗粒的实际水平，由于Dane颗粒代表着病毒基因在血液中的实际存在，因此LHBs的存在实际上不仅因意味着病毒基因，也代表着无病毒基因管状颗粒形式的存在。而临床的慢性肝炎病人中，血液中和肝细胞中都有管状颗粒，其浓度甚至是真病毒颗粒的上万倍。因此可以根据检测血液中LHBs的含量，来判断病毒携带者体内的乙型肝炎病毒是否杂进行复制。

近年来，临床开始出现前S1抗原诊断试剂盒，其利用单独表达前S1片段制备单克隆抗体，进行免疫学检测血清中前S1蛋白的存在，但是临床数据显示这种试剂盒存在诸多不足，最显著的就是漏检，临床已经发现大量PCR检测乙型肝炎病毒DNA阳性的标本使用前S1抗原诊断试剂盒检测是阴性。而大量基础研究表明：在乙肝病毒大蛋白上并不存在单独的前S1区段，而是存在前S1和前S2区组成的构象型前S区，前S区和S区一起构成大蛋白。大蛋白的前S序列对于乙型肝炎病毒的形成具有重要功能，该区域内的少量氨基酸的替换都会阻断病毒粒子的形成，这个区域也横跨了前S1和前S2的衔接区，因此前S区更应当作为一个整体来研究。

化学发光免疫分析技术是把高灵敏的化学发光分析方法和特异性强的免疫分析方法相结合发展起来的一项具有化学发光分析的高灵敏度和免疫分析法的高选择性的新的免疫分析技术。利用双抗体夹心法检测乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白，两株配对的单克隆抗体分别针对一个抗原表位，因而具有极高的特异性，可以迅速的从血清中高度特异的识别相应的抗原。单纯利用物理吸附把单克隆抗体包被到固相上(聚苯乙烯板，磁颗粒等)会存在单抗用量大，活性损失大等缺点，而且工艺优化较为繁琐，而将链亲和素包被于固相载体上，使捕获抗体生物素化，以上问题即可迎刃而解，本发明利用链亲和素固相，将生物素化单抗和碱性磷酸酶(ALP)标记单抗以适当的比例统一于一种液相内，将血清样品加入固相抗体，再加入两种标记单抗的混合液，固相上的链亲和素迅速与生物素结合，生物素化单抗和ALP标记单抗与血清中的大蛋白分子形成特异性的夹心结合，然后加入化学发光底物，利用化学发光仪检测相对发光强度，就可以定量分析反映血清中乙型肝炎病毒大蛋白的含量，进而体现乙型肝炎病毒的感染水平。

生物素-亲和素系统(biotin-avidin system，BAS)具有多级的信号放大作用，并且不增加非特异性干扰，且具有灵敏度高、特异性好、稳定性高、适用性强和实验成本低等特点。生物素亲和素免疫放大技术可以直接用标记亲和素连接生物素化大分子反应体系进行检测，这种方法称为标记亲和素-生物素法。待测反应体系可以利用生物素化抗体，使得亲和素-生物素系统与免疫分析检测体系偶联，放大终反应：先将针对不同抗原决定簇的固相抗体和生物素化抗体与抗原(标准抗原和待测抗原)同时反应，在固相载体表面形成双抗体夹心免疫复合物，再加入亲和素与复合物中的生物素结合，最终使反应信号放大，从而提高了免疫分析的灵敏度。