[发明专利]一种提取猪血抗菌肽的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种提取抗菌肽的方法，特别是关于一种提取猪血抗菌肽的方法。

背景技术

目前，由于抗生素的大量滥用，传统抗生素耐药性的问题越来越引起人们的关注，寻求一种无残留、无耐药性的新型抗菌药物已成为当务之急。抗菌肽因为其高效的抑菌效果和广泛而稳定的生物活性，逐渐引起人们的兴趣和关注。抗菌肽具有广谱、高效的抗微生物活性，还能促进动物生长，诱导动物的获得性免疫。而且其独特的抗菌机理不会使微生物产生耐药性，在机体内无残留，具有良好的应用开发前景，抗菌肽的应用可能会带来一场抗微生物战略的新革命。

我国是养猪业大国，猪血是生猪屠宰加工的废弃物，如何使该废弃物产生高值化的利用，具有废弃物加工利用和公共卫生等多方面的重要意义。有关研究确认，猪血中具有较强抗菌活性的多肽，因此开发研究一种从猪血中提取、纯化抗菌肽的成熟方法，可以一举多得。而目前在国内外还未见有从猪血中提取抗菌肽的技术方法和产品。

发明内容

本发明的目的是提供一种提取猪血抗菌肽的方法。

本发明提取猪血抗菌肽的方法，包括以下步骤：

1)将猪血粉溶入缓冲液中，然后在混合液中加入木瓜蛋白酶进行酶解，调整酶解液的pH为3.5～4.5；

2)将氯仿和亚硫酸氢钠加入到所述酶解液中进行脱色，然后调整脱色后酶解液的pH值至6.0～7.0，成为猪血抗菌肽的粗提物。

对所述粗提物进行以下纯化步骤，可得到纯化的猪血抗菌肽精制品：

1)冷冻干燥所述猪血抗菌肽的粗提物，并将所述粗提物过凝胶型阳离子交换柱，对交换柱进行洗脱，收集洗脱液；

2)对所述洗脱液进行真空冷冻干燥，成为猪血抗菌肽。

在上述过程中，缓冲液可以是pH＝7.0、浓度为0.05mmol/L的磷酸氢二钠-柠檬酸混合液。猪血粉与所述木瓜蛋白酶的重量份数之比为100∶1～3。酶解的温度为65-75℃，酶解的时间为8～10h。

脱色过程中，所述氯仿与所述酶解液体积份数之比为2～3∶5；亚硫酸氢钠的终质量百分浓度为0.5％～1.0％。

冷冻干燥猪血抗菌肽粗提物的温度一般为-50～-60℃，冷冻时间为24h～48h。

凝胶型阳离子交换柱可选择Sephadex G100凝胶柱；洗脱液可以为0.2mol/L的乙酸铵，洗脱的速度为10.0mL/cm².h；对洗脱液进行真空冷冻干燥的温度一般为-50～-60℃，冷冻干燥的时间为24h～48h。

本发明的原料猪血粉可以在市场上购买普通的猪血粉成品，也可以自行用以下方法进行制备，制备的方法包括以下步骤：

1)对新鲜猪血进行抗凝处理；

2)对所述猪血进行过滤，去除其中的纤维物质；

3)再对滤下物进行反复冻融，冷冻干燥，制成猪血粉。

本发明研究了猪血中的低分子肽类物质的分离纯化技术，并对分离纯化的肽类物质的生物学活性进行了研究，结果表明：猪血中多种肽类物质对白色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、沙门氏菌、大肠杆菌、嗜水气单胞菌等常见的致病菌有明显的抑制作用；猪血多肽还对鸡传染性支气管炎病毒(IBV)、鸡新城疫病毒(NDV)和鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)均有显著的灭活作用。更有意义的是，本发明分离到的多肽可提高机体非特异性免疫功能、鸡特异性免疫血清抗体水平和肠道黏膜免疫功能，并且能提高雏鸡日增重、降低料重比，促进鸡胚和雏鸡的生长发育。研究结果表明：本发明方法生产的猪血抗菌肽是一种新型的绿色抗微生物制剂和免疫调节剂，可广泛用于生猪屠宰厂等畜牧生产企业、饲料生产或饲料添加剂生产企业。

本发明具有以下优点：1、本发明方法实现了从猪血中提取具有较强抗菌活性的多肽物质，为生产抗菌肽提供了一个新的途径和方法。2、采用本发明方法生产的抗菌肽，属于天然提取物，具有天然、无毒、无污染、无残留、无副作用、高效抗菌等特点，是一种新型的绿色抗微生物药物。3、采用本发明方法生产的抗菌肽，具有广谱抗菌、抗病毒、不产生耐药性、有免疫调节作用等功能。4、本发明方法操作方便，所需设备简单，分离提取率高。5、实施本发明方法的原料猪血来源丰富，价格低廉，可以满足大规模深化加工的需要，具有很强的开发应用推广价值。原料猪血属于生猪屠宰加工的废弃物，本发明方法可使废弃物得到高值化的利用，因此本发明具有重要的公共卫生学意义。

附图说明

图1是猪血抗菌肽粗提物经Sephadex G100凝胶柱的层析曲线图

图2是猪血抗菌肽洗脱液对鸡多杀性巴氏杆菌的抗菌实验效果图