[发明专利]一种检测乙型肝炎病毒P基因YMDD变异的置换扩增法

权利要求书

1.一种检测乙型肝炎病毒P基因YMDD motif及变异的置换扩增法，将待测P基因RT区DNA/RNA作为保留杂交序列与包括一套以上的指示加首尾DNA的首尾互补序列杂交，连接酶反应，指示加首尾DNA的首尾共价连接，形成置换指示DNA环，再反向PCR扩增所述置换指示DNA环；所述待测P基因RT区包括YMDD、及变异YIDD和YVDD基因的DNA样本，所述保留杂交序列为待测基因中P基因RT区含变异序列长度为20-100bp序列；从变异基因开始断开形成左、右半部分序列，链长10-50base；所述指示DNA的序列是与HBV基因包括P基因RT区序列无关的基因序列，序列长度为80-1000bp；所述首尾互补杂交序列是指保留杂交序列的右半部分序列加在指示DNA上游首端，左半部分序列反接在指示DNA的下游尾端，形成指示加首尾DNA，所述连接酶反应包括0℃-20℃连接反应和热循环连接反应；所述反向PCR扩增是采用指示DNA正中间序列的右半部分作为反向引物Rev F，左半部分以互补反义序列作为反向引物Rev R，反向扩增置换指示DNA环，其特征在于：所述检测YMDD基因的其中一套指示加首尾DNA由以下引物扩增日本血吸虫谷胱苷肽-S-转移酶GST基因而得：

YMDD 3’端引物MR：5’-tg gat gat gtg gtW ttg gta ggt tat tgg aaa att aag g-3’，

YMDD 3’端引物MR：5’-t ata act gaa agc caR aca gtc ttt act ata tgc aat tc-3’；

所述检测变异YIDD基因的其中一套指示加首尾DNA由以下引物扩增日本血吸虫谷胱苷肽-S-转移酶GST基因而得：

YIDD 5’端引物IF：5’-t gat gat gtg gtW ttg gaa gag cat ttg tat gag c-3’，

YIDD 3’端引物IR：5’-at ata act gaa agc caR aca gtc tgc acg ctc ttt tgg-3’；

所述检测变异YIDD基因的其中一套指示加首尾DNA由以下引物扩增日本血吸虫谷胱苷肽-S-转移酶GST基因而得，

YVDD 5’端引物VF：5’-g gat gat gtg gtW ttg gat gaa ggt gat aaa tgg-3’，

YVDD 3’端引物VR：5’-ac ata act gaa agc caR aca gcc acc caa cat gtt gtg-3’；

所述反向扩增引物Rev F和Rev R如下：

Rev F：5’-at ggt gat gtt aaa tta aca c-3’；RevR：5’-atc aat ata ata agg aag att g-3’。

2.根据权利要求1所述的置换扩增法，其特征在于：所述连接酶反应中的连接酶指DNA ligase。

3.根据权利要求2所述的置换扩增法，其特征在于：DNA ligase为T4 ligase或Taq ligase。

4.根据权利要求1所述的置换扩增法，其特征在于：所述置换扩增体系中还包括有荧光分子信标或荧光染料。

5.根据权利要求4所述的置换扩增法，其特征在于：所述荧光分子信标为MolecularBeacon，Taqmen或LightCycler，荧光分子信标序列与待测模板保留序列杂交或与指示模板序列杂交。

6.根据权利要求4所述的置换扩增法，其特征在于：所述荧光染料为DNA荧光染料。

7.根据权利要求6所述的置换扩增法，其特征在于：所述DNA荧光染料为SYBRGreen。

8.一种检测乙型肝炎病毒P基因YMDD变异的试剂盒，包括DNA/RNA纯化试剂，Taq连接酶及缓冲液、抑制Olligo、dNTP、Taq Polymerase及缓冲液，DNA荧光染料或分子信标，凝胶电泳试剂，其特征在于：还包括分别检测P基因YMDD、P基因变异YIDD，P基因变异YVDD的三套指示加首尾DNA和反向扩增引物Rev F、Rev R，

所述检测YMDD基因的指示加首尾DNA由以下引物扩增日本血吸虫谷胱苷肽-S-转移酶GST基因而得：

YMDD 3’端引物MR：5’-tg gat gat gtg gtW ttg gta ggt tat tgg aaa att aag g-3’，

YMDD 3’端引物MR：5’-t ata act gaa agc caR aca gtc ttt act ata tgc aat tc-3’；

所述检测变异YIDD基因的指示加首尾DNA由以下引物扩增日本血吸虫谷胱苷肽-S-转移酶GST基因而得：

YIDD 5’端引物IF：5’-t gat gat gtg gtW ttg gaa gag cat ttg tat gag c-3’，

YIDD 3’端引物IR：5’-at ata act gaa agc caR aca gtc tgc acg ctc ttt tgg-3’；

所述检测变异YIDD基因的指示加首尾DNA由以下引物扩增日本血吸虫谷胱苷肽-S-转移酶GST基因而得，

YVDD 5’端引物VF：5’-g gat gat gtg gtW ttg gat gaa ggt gat aaa tgg-3’，

YVDD 3’端引物VR：5’-ac ata act gaa agc caR aca gcc acc caa cat gtt gtg-3’；

所述反扩增向引物RevF和RevR如下：

Rev F：5’-at ggt gat gtt aaa tta aca c-3’；RevR：5’-atc aat ata ata agg aag att g-3’。