[发明专利]副结核荧光PCR快速诊断试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种副结核荧光PCR快速诊断试剂盒，更具体地说是采用荧光PCR技术原理快速检测副结核病病原菌--副结核分枝杆菌的方法和试剂盒，属于生物技术领域。

背景技术

副结核病(Paratuberculosis，或Johne’s disease)是一种以牛、羊等反刍动物为主的消耗性、慢性肠炎，以动物持续性腹泻和慢性消瘦为特征，感染地区畜群的死亡率可达2％-10％，由于该病难于根除，其对养牛业造成的损失往往超过某些传染病。副结核病广泛分布于世界各国，对奶牛业和肉牛业危害较大，被国际动物卫生组织(oie)列为B类疫病，被我国列为二类疫病，是我国进出境牛羊等动物及产品重点检疫的疫病之一。该病的病原菌为副结核分枝杆菌(Mycobacterium avium subsp.paratubercilosis，M.paratuberculosis)。据文献报道，副结核分枝杆菌与人的一种慢性肠道疾病克罗恩氏病有关。一些研究报道了商业性加工牛奶被副结核分枝杆菌污染的情况，国外学者针对动物性食品中副结核分枝杆菌的污染及食品加工技术对病原菌杀灭能力开展研究，证实当菌体含量较高时，牛奶经巴氏消毒后尚有副结核分枝杆菌存活。因此，副结核分枝杆菌感染对奶制品食品安全亦构成威胁。

人及动物的结核、副结核病涉及多种病原菌，它们均属分枝杆菌属，结构相似，抗原性有交叉，常规方法难于鉴别。针对副结核分枝杆菌建立可靠的鉴别、鉴定技术，是有效防控和诊治副结核病的重要技术保障，对于公共卫生，养殖业健康发展、动物进出口贸易以及奶制品食品安全均具有重要意义。

目前国内外用于诊断副结核病的检验方法，大体上可分为3类：第一类是细菌学检验方法，如染色镜检、细菌培养和动物接种等；第二类是采用免疫学方法检测特异性抗体，如皮内变态反应、酶联免疫吸附试验(ELISA)和补体结合试验(CF)方法等；第三类是采用分子生物学检验方法，如PCR-RFLP、PCR-核酸探针、多重PCR等。

由于分枝杆菌生长缓慢，细菌分离培养周期长(常需数周时间)，传统的细菌学检查方法难于适应进出境检验检疫快速通关需求，也不利于疾病临床诊疗。ELISA和CF方法等免疫学方法在特异性方面尚存在争议，国内目前尚缺乏可靠的免疫学诊断试剂。随着分子生物学技术的发展，国内外众多实验室开展了副结核PCR方法研究，但检测方法和试剂盒缺乏规范化、标准化是影响PCR结果准确性的关键。

本发明方法采用TaqMan实时荧光PCR，其具体原理为在PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到报告基团发出的荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

荧光PCR等分子生物学方法具有快速、灵敏、特异性强的优点。随着分子生物学技术的发展及相关仪器设备、配套试剂的商业化推广，实时荧光PCR作为一种快速高效的检测技术，已在人、动植物传染病诊断领域得到愈来愈广泛的应用。它比常规PCR方法更为快速、敏感，并能有效避免交叉污染和便于实现自动化，迄今已应用于禽流感、链球菌、口蹄疫、乙肝等人畜疾病的快速诊断并已在国内建立检测方法标准。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一组检验副结核病毒的核苷酸序列。

本发明要解决的另一个技术问题是提供一种副结核荧光PCR快速诊断试剂盒。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一组检验副结核病毒的核苷酸序列，通过已发表的文献分析总结出副结核分枝杆菌的特异性核酸序列，采用Primer expess 2.0软件设计得到：是序列表SEQ ID No.1至序列表SEQ ID No.4所示的核苷酸序列，其中：

SEQ ID No.1和SEQ ID No.2为检验副结核分枝杆菌的引物对，SEQ ID No.3为检验副结核分枝杆菌的探针序列；

SEQ ID No.4为引物SEQ ID No.1和引物SEQ ID No.2扩增的核酸序列。