[发明专利]高耐受草甘膦的EPSP合酶及其编码序列

说明书

技术领域

本发明涉及一种新型高耐受草甘膦的EPSP合酶(5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合酶)，以及编码该合酶的核苷酸序列。

背景技术

草甘膦(glyphosate)为Monsanto公司产品Roundup中的主要活性成分，该除草剂是一种广谱灭生性、内吸传导型优秀除草剂，是全世界使用量最大的除草剂品种之一。但是，该除草剂也是一种非选择性除草剂，对农作物同样有着杀死作用。为在农业生产中使用草甘膦，须培育出具有草甘膦抗性或降解性质农作物。

草甘膦抑制植物莽草酸代谢过程中5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSP)活性，进而阻断芳香族氨基酸的生物合成而使植物死亡(S.R.Padgette et al.，in Herbicide-Resistent Crops：Agricultural，Environmental，Economic，Regulatory，and TechnicalAspects，S.O.Duke，Ed.(CRC Press，Boca Raton，FL，1996)，pp.53-84)，当前全球商业化种植的所有草甘膦抗性转基因作物均为针对EPSP所设计，是目前商业化转基因抗草甘膦作物的唯一作用机制。应用化学诱变细菌产生的aroA突变体，抗药性机理研究确证了aroA基因是草甘膦作用靶标EPSP合酶的编码基因。美国Mosanto和Calegene等公司在EPSP合酶的编码基因aroA及其抗草甘膦转基因植物等方面已申请了100余份专利，获得转基因抗草甘膦大豆、玉米、油菜、甜菜和棉花等作物系列品种，其中大豆等多种转基因作物已进入商品化生产。

目前尚未见到在核苷酸水平与已报道的EPSP合酶编码基因(aroA)同源性较低的抗草甘膦的EPSP合酶。

发明内容

本发明的目的是发现并人工合成新型高耐受草甘膦的EPSP合酶以及编码该合酶的核苷酸序列，并将该序列转入植物中，培育新型的高耐受草甘膦的转基因植物。

本发明首次发现了一种新型高耐受草甘膦的EPSP合酶，如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，以及编码该合酶的核苷酸序列，如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3所示。经序列结构分析和序列比较分析(见图3)，显示该EPSP合酶属于I型EPSP合酶。

本发明采集草甘膦极端污染环境中土壤样品，用免培养方法从中分离群落水平总DNA，构建群落水平总DNA粘粒文库，并筛选草甘膦抗性转化子；将转化子点于含20mM草甘膦的M9固体培养基上筛选抗性转化子。本发明还进行了草甘膦耐受实验，结果表明上述转化子具有非常强的草甘膦耐受活性。

本发明还进行了高耐受草甘膦的DNA片段的全核苷酸序列测定。分析结果表明，插入的片段大小为3151bp，其中包含了一个1335bp的阅读框，其序列如SEQ ID NO：2所示，它包含的核苷酸序列全长为1335个碱基，其开放读框位于885-2220位，编码全长为445个氨基酸的EPSP合酶(如SEQ ID NO：1所示)。

本发明对上述高耐受草甘膦的EPSP合酶基因进行了人工合成，其序列如SEQ ID NO：3所示。将人工合成的5′和3′端酶切位点为BamHI和HindIII位点EPSP基因，用于表达高耐受草甘膦的EPSP合酶以及构建相应的基因植物表达载体。将上述人工合成的EPSP基因，用BamHI和HindIII酶切后，连入相同酶切的载体pET28a得到重组质粒pETGR-79并将其转化大肠杆菌BL21(DE3)(Promega公司)。

本发明还进行了EPSP的酶活测定和动力学参数的测定，酶活性为10.477U/mg。K_i/K_m为2.16。根据动力学参数可知，GR-79 EPSP不仅具有较高的草甘膦抗性，而且还保持着与PEP较强的亲和性，这些特性将为用于转基因作物的培育提供可能。

本发明构建了高耐受草甘膦的EPSP合酶基因植物表达载体，利用叶盘法转化构建抗草甘膦的转基因烟草，经草甘膦抗性梯度实验证明，转基因植物能在含20mM草甘膦的培养基上良好生长。

本发明还提供了一种重组载体，它包含SEQ ID NO：2所述的DNA。本发明用上述重组载体转化宿主细胞，这些宿主包括原核细胞，也包括真核细胞。

本发明还提供了一种利用转基因技术将SEQ ID NO：2转化入植物的方法，以提高植物对草甘膦抗性，其步骤如下：

(1)将SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示序列可操作地连于植物表达调控序列，形成植物表达载体；

(2)将步骤(1)中的表达载体转入植物细胞；