[发明专利]一种检测喹诺酮类药物残留的胶体金试纸卡

说明书

技术领域

本发明涉及兽药残留的免疫化学速测技术领域，更具体地涉及一种检测喹诺酮类药物残留的胶体金试纸卡，借助胶体金标记显色的免疫层析反应，快速检测喹诺酮类药物残留。

背景技术

喹诺酮类(quinolones，QNs)药物是近20年来迅速发展起来的一类十分重要的广谱抗生素。在化学结构上，本类药物属于吡酮酸衍生物(pyridonecarboxylic acids，PCAs)，俗称“喹诺酮类”(QNs)。QNs抑制细菌DNA螺旋酶，抗菌谱广、高效、低毒、组织穿透能力强，已成为兽医临诊和水产养殖中最重要的抗感染药物之一，但由于其耐药性和潜在的致癌性引起广泛的关注。在组织中，恩诺沙星的标示残留物为恩诺沙星和环丙沙星，其中以肝脏组织和肾脏组织中的残留浓度最高，其次是鸡肉和脂肪附着的皮肤组织，恩诺沙星其代谢产物环丙沙星(CIF)仍具有生物活性。氧氟沙星(OFL)主要以原形药物的形式存在于组织中。培氟沙星(PEF)在体内代谢率接近100％，其代谢产物是诺氧沙星(NOR)。

目前QNs药物残留常用的检测方法有两种。一种是色谱分析，如高效液相色谱法(HPLC)，由于复杂的仪器设备和繁琐的过程，不适合现场监控和大量样本筛查。另一种为免疫学方法，如酶联免疫吸附法(ELISA)，它的缺点是检测时间长，费用较高，不利于在基层单位推广使用。而且，这两种方法都需要专业技术人员进行操作。

胶体金免疫层析(gold-immunochromatography assay，GIGA)是将胶体金作为示踪物应用于抗原抗体反应的一种新型免疫标金技术。

发明内容

本发明的目的在于提供一种敏感度高、操作简单、成本低的QNs快速检测试纸卡。

本发明的试纸卡包括反应膜、样本垫、结合物释放垫、吸水垫和背衬，在所述反应膜上具有包被喹诺酮类药物-载体蛋白偶联物的测试区和包被羊抗鼠IgG的质控区，所述结合物释放垫包被喹诺酮类药物单克隆抗体-胶体金标记物。

本发明将QNs-载体蛋白偶联抗原固化于反应膜测试区内，并用胶体金标记QNs单克隆抗体，通过待测样本中的QNs和包被在反应膜上的QNs-载体蛋白偶联物共同竞争QNs单克隆抗体-胶体金标记物，根据测试区条颜色深浅或有无红色条带来判断待测样本液中是否含有QNs残留。检测时，样本滴入试剂卡孔内，当QNs在样本中浓度低于10ng/ml时，胶体金抗体在层析过程中会被固定在反应膜上的QNs的偶联物结合，在测试区(T)和质控区(C)内各出现一条红色条带。如果QNs在样本中浓度高于10ng/ml时，胶体金抗体与样本中的QNs全部结合，从而在(T)区内因为竞争反应不与喹诺酮偶联物结合而不出现红色条带。阴性样本在检测过程中由于缺少抗体抗原竞争反应，将会在(T)区与(C)区内出现红色条带。如图2所示。

阳性：当(C)区显示出红色条带，而(T)区不显色，判为阳性，表示QNs含量超过10ng/ml，用“+”表示。

阴性：当(C)区显示出红色条带，(T)区同时显示出红色条带，且(T)带颜色接近或浅于(C)带时，判为阴性，表示QNs含量小于10ng/ml，用“-”表示。

无效：当(C)区不显示出红色条带，则无论(T)区显示出红色条带与否，该试纸卡判为无效。

本发明还提供了制备上述试纸卡的方法，其包括步骤：

1)制备包被喹诺酮类药物单克隆抗体-胶体金标记物的结合物释放垫；

2)制备具有包被喹诺酮类药物-载体蛋白偶联物的测试区和包被羊抗鼠IgG的质控区的反应膜；

3)将1)和2)制备好的结合物释放垫、反应膜与样本垫、吸水垫和背衬组装成试纸卡。

具体地说，其步骤包括：

(1)将QNs半抗原与载体蛋白偶联，形成QNs半抗原-载体蛋白偶联物；

(2)用QNs半抗原-载体蛋白偶联物免疫小鼠，将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞通过融合、筛选，得到分泌QNs单克隆抗体的杂交瘤细胞株；

(3)提取小鼠IgG免疫健康山羊，得到羊抗鼠IgG抗体；

(4)用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金；

(5)将制备的QNs单克隆抗体加入制备的胶体金中，得到QNs单克隆抗体-胶体金标记物；

(6)将结合物释放垫用含0.1～0.5％酪蛋白的磷酸氢二钾和磷酸二氢钾混合缓冲液浸泡30秒，在37℃烘2h，然后将QNs单克隆抗体-胶体金标记物包被在结合物释放垫上；

(7)将QNs-人血清白蛋白偶联物(HSA)包被在反应膜上构成测试区，并将羊抗鼠IgG包被在反应膜上构成质控区，用含0.5％脱脂奶粉的封闭液进行封闭；