[发明专利]一种动物体细胞克隆方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种动物体细胞克隆方法。

背景技术

动物体细胞克隆也叫体细胞核移植，就是将动物的体细胞经同期化处理后，通过核移植的方法，将体细胞导入除去了染色质的成熟卵母细胞，激活后在体外发育成克隆胚胎并移植到受体动物内，经妊娠后生产出克隆动物的方法。从理论上讲这种方法可以无限制地克隆动物个体，因为分化的各种体细胞核是取之不尽的。克隆羊“多莉”的诞生是克隆技术发展史上的一个里程碑。它从理论上证明了已高度分化了的动物细胞仍然具有发育成为一个完整生物体的全能性，在适当条件下通过基因组的重新编程就可能发育成为一个新的个体，这对发育生物学、遗传学理论的深入发展已经产生重大的影响。该技术的应用将会带来巨大的经济效益，首先能使遗传性状优秀的个体大量增殖，大大加快动物育种的进程，例如，一头高产奶牛，正常情况下，一生所能生产的母牛头数是很有限的，而且后代不纯；不可能性状全像母亲，既不能保证是高产母牛。一般说来，要培育出一个纯度达98％的品系，需要进行20代的兄妹间交配。在牛，这就意味着需要100年的时间。而且，长时间的近亲交配会导致生育能力的明显降低。此外，一群体内的遗传优秀个体的迅速增殖可导致快速的遗传进展。其次，可用来作为培育转基因动物的生产平台，提高转基因动物的效率。第三可以预先选定克隆后代的性别，对于需要特定性别的动物家畜产业具有重要的实践意义。第四可以用于珍稀和濒危动物的扩繁和保种，第五满足生物医学研究对实验动物的特殊需要，可大大减少实验动物的数量，而且能提高实验的准确性，此外，以此技术为基础还为分子生物学、发育生物学、再生生物学等学科提供了独一无二的研究平台，其中治疗性克隆技术的建立为医学的发展开辟了一个全新的领域。

尽管体细胞克隆技术有着十分巨大的意义和经济效益，但从目前看该技术还远不完善，要想使体细胞克隆牛的制备达到工厂化和商品化大规模生产，还有一系列的问题需要克服，主要是培育克隆动物的总体效率仍然很低，据报道目前国际上克隆总体效率低于5％。这主要表现在流产率高，体细胞克隆动物的流产率达40％--100％，在怀孕的牛中还有相当多的牛表现出羊水过多，胎儿体形过大导致胎死腹中；另外出生死亡率高，平均只有一半的新生克隆个体可以存活下来，这些都是导致克隆效率低的主要原因。

从目前结果看，克隆动物胎儿的胎盘发育不正常是导致克隆动物流产和死亡的一个重要原因。与正常动物胎儿的胎盘进行比较，可观察到克隆动物的胎盘普遍存在胎盘过大，以小鼠为例克隆小鼠的胎盘平均比对照组大约30％。另外克隆动物胎盘的子叶数量明显偏多，且子叶个体大，以牛为例，克隆牛的胎盘中子叶的数量比对照组少了1/3-1/2，而且子叶的个体明显偏大，通过对克隆动物胎盘和子叶的组织学观察也发现与对照组有明显的不同。研究表明克隆牛胎儿的胎盘上基因的表达，特别是印记基因的表达不很正常，是导致克隆胎盘发育不正常的重要原因。

通过对移植到受体内的克隆胚胎跟踪观察发现在移植后大部分胚胎可以着床和发育，妊娠率与体外授精(IVF)胚胎相比并没有太大差别，但2-3个月后有40％的胎儿流产，在未流产的胎儿中也有大约1/3胎儿发育明显迟，最终导致胎儿死亡，在能继续发育的胚胎中，还有相当多的受体存在羊水过多或巨胎现象，以上情况都说明克隆动物胎儿与母体之间的物质运输存在很大的问题，本实验室在制备克隆牛的过程中也多次发现因为胎盘溃烂致使克隆牛胎死腹中的情况，可见胎盘发育异常是导致克隆动物发育失败的重要原因。这主要是在体细胞克隆过程中，供体细胞核没有能够完全重编程或表现遗传修饰发生改变而造成的。在胚胎发育到囊胚后，胚胎会分化为滋养层细胞和内细胞团细胞，前者发育成为胎盘，后者发育成胎儿，在发育成胎盘的细胞中，主要由4倍体和双核细胞组成。

发明内容

本发明的目的是提供一种动物体细胞克隆方法。

本发明所提供的动物体细胞克隆方法，是将经体外受精得到的处于8-16细胞期的4倍体卵裂球移入8-16细胞期的体细胞克隆胚内得到复合胚，培养该复合胚得到克隆动物。

所述动物具体可为牛。

其中，所述4倍体卵裂球可按照如下方法得到：将由体外受精卵分裂到2细胞期的胚胎进行融合得到4倍体细胞，培养该4倍体细胞至8-16细胞期，得到处于8-16细胞期的4倍体卵裂球。

所述4倍体卵裂球具体可处于8细胞期，所述体细胞克隆胚具体可处于8细胞期。