[发明专利]与甜瓜白粉病抗性基因Pm-2F紧密连锁的特异片段及其获得方法

权利要求书

1.一种与甜瓜白粉病抗性基因Pm-2F紧密连锁的特异片段，其特征在于，其如序列表SEQ ID NO.1和SEQ ID No.3所示。

2.一种与甜瓜白粉病抗性基因Pm-2F紧密连锁的特异片段的获得方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)与甜瓜白粉病抗性基因Pm-2F紧密连锁的特异片段的筛选：提取基因组DNA，使用SSR引物对基因组DNA进行PCR反应，对PCR产物进行电泳分析；通过BSA法，寻找与甜瓜白粉病抗性基因Pm-2F紧密连锁的特异SSR片段，测定连锁距离并验证连锁关系；

(2)与甜瓜白粉病抗性基因Pm-2F紧密连锁的特异扩增序列的获得：对SSR产物进行回收、克隆和测序，获得特异片段序列。

所述步骤(1)中SSR引物为SSR引物509；

所述SSR引物509上游引物序列为：5’-CTGGCCCCCTCCTAAACTAA-3’，509下游引物序列为5’-CAAAAAGCATCAAAATGGTTG-3’。

3.根据权利要求2所述的一种与甜瓜白粉病抗性基因Pm-2F紧密连锁的特异片段的获得方法，其特征在于，所述步骤(1)中的提取基因组DNA是指将1.5克叶片在液氮中研磨成粉末，加入9ml 2％CTAB提取液，混匀65℃水浴1小时；从水浴中取出离心管，加1/3体积5M醋酸钾，混匀冰浴20分钟；加入等体积氯仿/异戊醇抽提两次；取上清加入2/3体积异丙醇沉淀DNA；洗涤缓冲液洗涤一次，吹干，加TE缓冲液溶解；加入RNaseA使其终浓度达100μg/ml，混匀37℃水浴1小时；用等体积氯仿/异戊醇抽提；取上清，加入1/2体积7.5M醋酸铵和2倍体积无水乙醇沉淀DNA；70％乙醇洗涤沉淀，吹干，加适量ddH₂O溶解DNA。

4.根据权利要求2所述的一种与甜瓜白粉病抗性基因Pm-2F紧密连锁的特异片段的获得方法，其特征在于，所述步骤(1)中的PCR反应条件是：25μl的反应体系中含有2.5μl 10×buffer，2.0μl 25mM MgCl₂，2.0μl 2.5mM dNTP，1U Taq DNA聚合酶，30ng SSR引物，50ng模板DNA；反应程序为，94℃预变性5min，然后94℃ 1min，52℃ 1min，72℃2min下循环35次，72℃延伸7min后保存在4℃条件下。

5.根据权利要求2所述的一种与甜瓜白粉病抗性基因Pm-2F紧密连锁的特异片段的获得方法，其特征在于，所述步骤(2)中的SSR产物的回收、克隆和测序是指用Gene-Clean试剂盒纯化回收已证明是连锁的SSR特异片段，然后连接到pGEM@-T Vector Easy载体上，将重组质粒DNA用EcoRI进行酶切处理，用SSR-PCR验证扩增产物，观察扩增出的片段是否与原来的目的片段和酶切片段一致，并测序。