[发明专利]快速脱除百合三种病毒的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及快速脱除百合三种病毒的方法。

背景技术

百合三种病毒LSV、CMV、LMoV是造成百合经济作物减产的主要原因。现有的脱去上述三种病毒的主要方法有如下几种：1)茎尖分生法：茎尖分生区是病毒含量最少的区域。茎尖分生组织仅限于顶端圆锥区，其长度不超过0.1mm进行的无菌培养。但，这么小的茎尖实际上很难取得，成活率很低，且培养成苗的时间也很长。因此，在实际培养中，多采用带有叶原基的生长锥来培养，通常0.2～0.4mm(毫米)的茎尖分生组织，但，带毒的几率增大。Kim对带LSV、CMV、LMoV的铁炮百合‘Georgia’进行茎尖脱毒；席梦利也采用茎尖脱毒对宜兴百合进行脱毒，获得了组培苗，但未进行病毒检测。2)热处理是利用病毒和寄主植物对高温的忍耐性的差异，选择一定的温度和适当的处理时间，使寄主体内的病毒钝化失活，从而达到减轻病毒危害的目的。应用热处理与茎尖培养相结合方法能够更加有效脱除病毒。38±1℃，6h或25℃8h热空气和50±1℃，40min恒温水浴结合茎尖培养脱除了宜兴百合的CMV病毒。3)抗病毒药剂法：其作用原理是抗病毒药剂在三磷酸状态下会阻止病毒RNA帽子结构形成，抑制病毒增殖或移动。Blom-Barnhoorn采用不同的病毒唑浓度(20和100mg/L)，分别获得了两个百合品种‘Georgia’和‘Connecticut King’的无毒苗；Xu-PinSan在鳞片诱导培养基中加5mg/L(毫克/升)的病毒唑和硫尿嘧啶，获得80％无毒百合植株。Dapkuniene将组培小籽球在加有5mg/L(毫克升)苄基腺嘌呤和0.1mg/L NAA的MS培养基中获得了4个品种的无毒百合籽球。但现有的检测方法中还存在如下问题：茎(根)尖培养(stem or shoot tip culture)是切取茎(根)的先端部分或茎(根)尖分生组织部分进行的无菌培养。严格地讲，茎尖分生组织仅限于顶端圆锥区，其长度不超过0.1mm。但这么小的茎尖实际上很难取得，且培养成苗的时间也很长。因此，在实际培养中，常采用带有叶原基的生长锥来培养。实际操作不可能得到不超过0.1mm的茎尖。较大茎尖脱毒率大为降低，甚至不能脱毒。应用热处理与茎尖培养相结合方法能够更加有效脱除病毒。但实际上38±1℃，6h和50±1℃ 40min恒温水浴下，茎尖培养不能成活，25℃8h热空气不能脱除LSV、LMoV。抗病毒药剂法中抗病毒剂的使用浓度越高，处理时间越长脱毒效果越加明显，但同时，高浓度抗病毒剂对植株的生长有明显伤害。

获得无病毒植株的难易程度与品种和感染病毒的种类有直接关系。同时，与病毒检测技术方法相关，早期均采用指示植物和ELISA法检测，灵敏度较低，很多情况下并没有真正完全脱除病毒。

发明内容

本发明针对上述三种方法的缺陷，提供一种快速脱除百合三种病毒的方法，并结合灵敏的病毒检测方法，解决成活率低，脱毒率低，再生速率低等技术问题，从而达到高效快速脱毒的目的。

快速脱除百合三种病毒的方法，其特征在于：将茎尖分生组织接种于含有病毒唑的培养基上，所述茎尖大小为0.5mm～0.8mm，病毒唑浓度为4mg/L～6mg/L。

培养基成分为：MS+IBA1.0mg/L+NAA0.1mg/L，蔗糖3％，琼脂6g/L。

培养条件：2000～3000lx，光照时间14h/d，培养温度20～25℃。

本申请组合茎尖脱病法及抗病毒药剂法，将切取的茎尖分生组织增大，这样可以缩短了其培养的时间，但其所含病毒量增加了，采用一定浓度的病毒唑对其进行脱毒，由于病毒含量提高，其病毒唑的浓度应控制在一定的范围内，浓度太高，易造成死亡，浓度太低起不到脱毒的效果，本发明经过反复实验得出，茎尖大小为0.5mm～0.8mm，病毒唑浓度为4mg/L～6mg/L，脱毒效果最好，且脱毒组织经过3个月，18个月和栽培成花全过程检测，证明本发明方法脱毒率达92％。

本发明方法采用茎尖大小为0.5mm～0.8mm作为脱毒培养组织，容易切取，而且成活率和再生速率都大大提高了，由于茎尖增大了，其耐病毒唑浓度也提高了，所以可以在较高病毒唑浓度(4mg/L～6mg/L)下脱除病毒，脱毒率大大提高。

附图说明

图1：部分处理组合生长4周状况

其中A：0.5～0.7茎尖和2mg/L病毒唑形成愈伤组织，B：0.5～0.7茎尖和8mg/L病毒唑愈伤组织死亡，C：0.2～0.4茎尖和2mg/L病毒唑形成愈伤组织，D：1.0～1.2茎尖和4mg/L病毒唑形成的植株