[发明专利]多重PCR检测大肠埃希菌的方法、试剂盒及其应用

权利要求书

1.一种PCR试剂盒，用于多种致腹泻大肠埃希菌的分型检测，该试剂盒包括：

1).选自五种引物对中的至少一种引物对，五种引物对分别特异于基因eaeA，aggR，ipaH，lt和stxI；

2).PCR反应缓冲液，聚合酶，dNTP；

3).对应1)中引物对的标准阳性模板；

4).一份进行PCR反应的说明书；以及

5).上述1)到4)被包装在包装材料中。

2.根据权利要求1所述PCR试剂盒，其特征在于，所述引物对为两种至五种引物对的组合，且所述引物对相互分离装配于试剂盒中。

3.根据权利要求1所述PCR试剂盒，其特征在于，所述引物对为两种至五种引物对的组合，且所述引物对为混合物装配于试剂盒中，引物混合物按eaeA，aggR，ipaH，lt和stxI五种引物对的摩尔数10～15∶15～20∶1∶15～25∶20～30比例混合。

4.根据权利要求1所述PCR试剂盒，其特征在于，其中所述引物对为各自单独包装的五种引物对。

5.根据权利要求3所述PCR试剂盒，其特征在于，其中所述引物对为五种引物对形成的混合物，且以eaeA，aggR，ipaH，lt和stxI五种引物对按摩尔比418∶482∶32∶627∶739混合。

6.根据权利要求1所述PCR试剂盒，其特征在于，所述标准阳性模板为对应含有基因eaeA，aggR，ipaH，lt和stxI的不同菌液等比混合得到的多重PCR反应模板；所述聚合酶为rTaq酶。

7.根据权利要求1至6任一所述PCR试剂盒，其特征在于，所述五种引物对分别为：

1)特异于基因eaeA引物对：

其中一个序列是：AACATTATGGAACGGCAGAGGT；

另一个序列是：GTAAAGCGGGAGTCAATGTAACG；

2)特异于基因aggR引物对：

其中一个的序列是：GCTGATGCTGACGATTCTGTATT；

另一个的序列是：TCCTTCTCGATTGTGTTTCTGAC；

3)特异于基因ipaH引物对：

其中一个的序列是：GCGCTCACATGGAACAATCTC；

另一个的序列是：TCACTCCCGACACGCCATAG；

4)特异于基因lt引物对：

其中一个的序列是：GCATAATGAGTACTTCGATAGAGGA；

另一个的序列是：TCACACCAAATTAACACGATACC；

5)特异于基因stxI引物对：

其中一个的序列是：CATTCGTTGACTACTTCTTATCTGG；

另一个的序列是：TAGGTACAATTCTGGCAACTCG。

8.一种用于多种致腹泻大肠埃希菌的分型检测的方法，该方法包括：

1)使用权利要求1至7任一所述的PCR试剂盒；

2).形成一个PCR反应体系，对含有未知病菌的样品进行PCR反应；

3).将扩增产物与标准阳性模板扩增产物进行比对，确定扩增产物的组成，所述扩增产物的组成反映致腹泻大肠埃希菌分型。

9.根据权利要求8所述检测方法，其特征在于，试剂盒中每一种引物对在反应体系中的终浓度范围为从1nmol/L到1000nmol/L，优选终浓度在30nmol/L到800nmol/L之间；五种引物对同时使用时，最优选eaeA、aggR、ipaH、lt、和stx1五对引物对终浓度分别依次为418.2nmol/L、482.5nmol/L、32.2nmol/L、627.3nmol/L、和739.9nmol/L。

10.用于多种致腹泻大肠埃希菌的分型检测PCR试剂盒中的引物对，为以下所述五种引物对中的一种：

1)特异于基因eaeA引物对：

其中一个序列是：AACATTATGGAACGGCAGAGGT；

另一个序列是：GTAAAGCGGGAGTCAATGTAACG；

2)特异于基因aggR引物对：

其中一个的序列是：GCTGATGCTGACGATTCTGTATT；

另一个的序列是：TCCTTCTCGATTGTGTTTCTGAC；

3)特异于基因ipaH引物对：

其中一个的序列是：GCGCTCACATGGAACAATCTC；

另一个的序列是：TCACTCCCGACACGCCATAG；

4)特异于基因lt引物对：

其中一个的序列是：GCATAATGAGTACTTCGATAGAGGA；

另一个的序列是：TCACACCAAAATTAACACGATACC；

5)特异于基因stxI引物对：

其中一个的序列是：CATTCGTTGACTACTTCTTATCTGG；

另一个的序列是：TAGGTACAATTCTGGCAACTCG。