[发明专利]利用Nsp2基因缺失构建PRRSV基因缺失疫苗毒株的方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用Nsp2基因缺失构建PRRSV基因缺失疫苗毒株的方法及其应用。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)最初被称为“猪神秘病”，自从20世纪80年代末期在美国发现以来，广泛流行于各养猪国家，已成为危害全球养猪产业经济的最重要疾病之一。该病的主要特征是种猪繁殖障碍，哺乳仔猪死亡率升高，各年龄段猪特别是哺乳和保育阶段仔猪的呼吸道疾病以及生长和育肥猪的流感样症状。

作为PRRS的致病因子，猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive andrespiratory syndrome virus，PRRSV)首先在荷兰和美国分离到，并分别作为欧洲型(LV)和美洲型(VR-2332)的原型毒株。PRRSV基因组为单股正链RNA，长约15kb，5’端有帽子结构，3’端有poly(A)尾。基因组RNA有9个开放阅读框(open-reading frames，ORFs)。位于5’端的两个大的ORF约占基因组的五分之四，编码病毒的复制酶多聚蛋白，并在自剪切蛋白酶的作用下产生13种非结构蛋白，其余7个ORF中除了ORF3尚存争议外，都编码病毒的结构蛋白。

PRRSV非结构蛋白2(Nsp2)具有胰凝乳蛋白酶样(或微RNA病毒3C样)半胱氨酸蛋白酶结构域、线形B细胞表位和潜在的T细胞表位。推测Nsp2可能与病毒的细胞/组织嗜性和种属特异性、Nsp2/3和Nsp4-8的剪切、双脂膜囊泡(double lipid membranevesicles)和多蛋白病毒复制酶复合体(multiprotein viral replication complexes)的组装等有关。然而，除了B细胞表位以外，其它功能都未被证实。无论从核苷酸还是氨基酸水平上分析，Nsp2都是PRRSV变异性最大的区域之一。Nsp2基因的变异有点突变、插入和缺失突变，不仅在异型毒株之间出现，也常见于同型毒株之间(Fang Y，Kim D Y，Ropp S，et al.Heterogeneity in Nsp2 of European-like porcine reproductive andrespiratory syndrome viruses isolated in the United States.Virus Res，2004，100(2)：229~235)。Nsp2的化学结构多样性与病毒的生物学功能以及临床特征有何关系尚不清楚。反向遗传技术为研究RNA病毒的复制、致病性、毒力差异的分子基础、蛋白功能、病毒与宿主的相互作用以及开发新型疫苗和病毒载体提供了一个崭新的技术平台。目前，已经有5株PRRSV毒株——LV、VR-2332、NVSL#97-7895、P129和PL97-1的感染性克隆获得成功。然而，后续的研究几乎都集中于结构蛋白和非编码区的功能。陈小云等已构建了PRRSV BJ-4株全长cDNA分子(陈小云，杨汉春，郭鑫.猪繁殖与呼吸综合征病毒BJ-4株全长cDNA的构建.农业生物技术学报，2005，13(1)：61-65)。

发明内容

本发明的目的是提供一种降低PRRSV BJ-4株毒力的方法。

本发明所提供的降低PRRSV BJ-4株毒力的方法，是连续缺失PRRSV BJ-4株基因组的Nsp2编码区中长度为69nt的核苷酸片段，得到毒力降低的毒株；所述69nt核苷酸片段的核苷酸序列如GenBank Accession Number AF331831的自5′末端第2795至2863位所示。

为了便于在所得到的毒力降低毒株中插入外源基因，所述方法中，在所述连续缺失PRRSV BJ-4株的Nsp2编码区中长度为69nt的核苷酸片段的基础上，还可再在GenBankAccession Number AF331831的自5′末端第2795至2863位中插入限制性内切酶位点，如HpaI位点。

上述任一种方法获得的毒株也属于本发明的保护范围。

上述任一种方法获得的毒株可用于制备预防和/或治疗猪繁殖与呼吸综合征疫苗。