[发明专利]植物中基因表达的dsRNA介导的调节

说明书

本申请是基于申请号为99807888.3，申请日为1999年5月25日，发明名称为“植物中基因表达的dsRNA介导的调节”的中国专利申请的分案申请。

本发明涉及改变植物中基因表达的方法，特别是利用该基因的有义和反义RNA片段，并且涉及利用本发明的方法获得的基因表达改变的植物。

分子生物学和植物转化技术的发展使得能产生具有希望的不同性状的转基因植物，这些性状例如，对昆虫及真菌或微生物病原体的抗性，对除草剂的耐受性或增值性状。这些希望的性状主要是通过植物中转基因过量表达而获得的。然而，在某些情况中，修饰植物使得特定基因的表达改变，从而产生具有希望的表型或具商业价值的特性的植物也是希望的。现有的改变基因表达的方法通常依赖于有义或反义抑制技术。例如，矮牵牛属(Petunia)中查耳酮合酶基因的有义抑制产生色素形成改变的花，番茄中多聚半乳糖醛酸酶基因的反义抑制导致延迟的果实成熟。遗憾的是，这些方法在改变基因表达的能力方面常常是易变的且无法预测的，在许多情况下不能实现特定基因活性的完全破坏。改变基因表达的其他方法包括催化核糖核苷酸或核酶的应用，这在技术上是有挑战性的，或者同源基因破坏，虽然在遗传学上这是最希望的，但遗憾的是利用现有技术不足以常规用于这些目的。

因此，一直需要但尚未找到能有效地且可预测地改变植物细胞中基因表达，而获得具有改善的或商业重要特性的植物的新方法。

本发明涉及利用分子技术和遗传转化产生具有改善的特性和性状的植物。特别是，本发明涉及利用基因的有义和反义RNA片段改变植物细胞中基因表达的方法。重要地，这些有义和反义RNA片段能够形成双链RNA分子。本发明还涉及用这些方法获得的植物细胞，由这些细胞衍生的植物，这些植物的后代和这些植物产生的种子。在这些植物细胞或植物中，特定基因之基因表达的改变比利用本领域已知的现有方法获得的特定基因之基因表达的改变更有效、更有选择性且更可预测。

因此本发明提供：

一种方法，包括向植物细胞中引入靶基因的有义RNA片段和该靶基因的反义RNA片段，其中该有义RNA片段和反义RNA片段能形成双链RNA分子，其中靶基因在该细胞中的表达被改变。在一个优选实施方案中，RNA片段包含于两种不同的RNA分子中。在另一个实施方案中，此RNA片段在被引入细胞之前混合。在另一个优选实施方案中，此RNA片段在被引入细胞之前，在能使其形成双链RNA分子的条件下混合。在另一个优选实施方案中，这些RNA片段被顺序引入所述细胞中。在又另一个优选实施方案中，这些RNA片段包含于一种RNA分子中。在这种情况中，该RNA分子优选地能够折叠，使得其中包含的所述RNA片段形成双链RNA分子。

本发明另外提供：

一种方法，包括向植物细胞中引入能在该细胞中表达靶基因的有义RNA片段的第一种DNA序列，和能在该细胞中表达靶基因的反义RNA片段的第二种DNA序列，其中所述有义RNA片段和反义RNA片段能形成双链RNA分子，其中靶基因在该植物细胞中的表达被改变。在一个优选实施方案中，这些DNA序列稳定地整合于植物细胞的基因组中。在一个优选实施方案中，DNA分子另外含有与所述第一种或第二种DNA序列有效连接的启动子。在另一个优选实施方案中，第一种DNA序列和第二种DNA序列包含于两种不同的DNA分子中。

或者，第一种DNA序列和第二种DNA序列也可包含于一种DNA分子中。在此情况中，第一种DNA序列和第二种DNA序列优选地包含于该DNA分子的同一DNA链中，并且优选地，有义RNA片段和反义RNA片段包含于一种RNA分子中。优选地，该RNA分子能够折叠，使得其中包含的所述RNA片段形成双链区。在另一个优选实施方案中，有义RNA片段和反义RNA片段包含于或者表达为两种RNA分子。在此情况中，第一种DNA序列和第二种DNA序列优选地与双向启动子有效连接，或者，另外，第一种DNA序列与第一种启动子有效连接，而第二种DNA序列与第二种启动子有效连接，其中第一种启动子和第二种启动子是相同的启动子或不同的启动子。在另一个优选实施方案中，第一种DNA序列和第二种DNA序列包含于所述DNA分子的互补链中。

在又一个优选实施方案中，在所述DNA分子中，第一种DNA序列是第二种DNA序列的互补DNA链。