[发明专利]一种预防仔猪腹泻疫苗的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种预防仔猪腹泻疫苗的制备方法，属于微生物基因工程疫苗制备技术领域。

背景技术

初生仔猪由于抵抗力弱，环境及母体内的病原微生物多，容易导致仔猪腹泻，严重影响出栏率。仔猪黄痢主要发生于1周龄以内的仔猪，多呈急性发作，发病率和死亡率都很高；仔猪白痢主要发生于3-20天的仔猪，死亡率较白痢略低(朱凤娟，云南农业，2006：26(1))；仔猪红痢发生于7日龄以内的仔猪，主要侵害3日龄以内的仔猪(李玉泉，河南畜牧兽医，2004：25(7))。仔猪腹泻传染快、疗程长，使断奶窝重和饲料报酬降低，严重制约着养猪业的发展。目前对此病的主要防治途径有疫苗免疫预防和抗生素治疗。母猪可在分娩前1天注射长效抗菌剂，仔猪初生后立即口服抑菌药物，也可用微生态制剂口服，调节肠道消化机能，抑制有害菌的生长，防止疾病的发生(李军民，刘丽艳，湖北畜牧兽医，2006：30(1))。药物治疗会造成药物残留，影响肉质，对人类的健康构成潜在的危害，而且由于耐药菌株的产生，治疗效果不理想。现有的疫苗主要有灭活疫苗和一些双价基因工程疫苗K88-K99(洪孟民，张景六，蔡瑞珠，生物工程学报，1985，1(1))，K88ac-LT_B(李丰生，陈添弥，黄翠芬，生物工程学报，1987，3(2))，K99-F41(黄培堂，程军，李丰生，生物工程学报，1990，6(1))，ST-LT(Klipstein FA，EngertRF，Infect jmmun，1982)等；灭活苗针对性强，但特异性抗原含量少，不能产生足够的母源抗体，免疫效果差；双价基因工程疫苗均取得了较好的免疫效果，但由于ETEC血清型众多，现有疫苗均未达到十分理想的免疫效果。因此，研制可以同时防治仔猪黄白红痢且保护效力更高的疫苗成为养猪业亟待解决的课题。

发明内容

本发明的目的是提供一种预防仔猪腹泻疫苗的制备方法，解决了当前仔猪腹泻流行，且现有治疗方法效果不理想的问题。

本发明所说的预防仔猪腹泻疫苗的制备方法包括以下步骤：

(1)从发病猪体内分离到致病菌，经生理生化鉴定和分子生物学鉴定表明该菌为产肠毒素型大肠杆菌菌；(2)以分离的致病菌为研究对象，PCR扩增得到ST₁和LT_B基因，利用定点突变技术将形成ST₁分子内二硫键的半胱氨酸碱基进行突变，将突变的ST₁基因与LT_B基因融合，定向克隆于原核表达载体pET-28b中，得到重组质粒pBETST₃LT_B；(3)将产气荚膜梭菌的α-β毒素保护性抗原基因通过分子生物学手段构建到ST₁-LT_B基因下游，得到了重组质粒pBETST₃LT_Bαβ，在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达；(4)将构建的基因工程菌株BL21(DE3)(pBETST₃LT_Bαβ)灭活后的菌悬液按一定质量比辅以一定浓度的中草药制剂即可。草药制剂的常用浓度为10g/L。菌悬液与中草药制剂合适的混合质量比为7∶3。常用的中草药制剂为黄芪、白术、蒲公英和枸杞的任意比例混合制剂，所用制剂一般是上述混合物粉碎后加水煎制而成的汤剂。

将得到的基因工程疫苗经免疫原性研究，结果显示本实验构建的四价基因工程菌株具有较好的免疫保护作用。

利用本发明制备的疫苗腹腔注射于昆明小鼠，经过安全性检测后，试验用的小鼠一切正常，内脏剖检未见任何异常。将疫苗加入不同剂量的中草药佐剂采取皮下注射的方式免疫小鼠，设生理盐水及空载质粒对照组，首免15天后二免，再15天后以强毒株C83905攻毒，对照组小鼠全部死亡，免疫组的小鼠免疫保护率可达到80％，中草药对提高机体免疫力有一定的效果。取实验后免疫和对照组小鼠的内脏作石蜡切片，病死小鼠小肠绒毛上皮细胞松散、基底层排列不紧密，肾部有出血点；存活小鼠各组织结构完整，未见异常。

本发明取得的有益效果是：该方法制备的疫苗可以同时防治由产肠毒素型大肠杆菌和产气荚膜梭菌引起的仔猪黄白红痢，且保护效果较好，克服了以往抗生素治疗产生的药物残留、成本高、且易产生耐药性的缺陷。

具体实施方式

附图说明

图1是疫苗的保护性实验石蜡组织切片HE染色结果图。