[发明专利]橡胶树胚性愈伤组织高效遗传转化方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种植物遗传转化方法，具体涉及一种以继代增殖的胚性愈伤组织为转化受体材料的橡胶树高效遗传转化方法。

背景技术

1991年马来西亚橡胶研究所的Arokiaraj等在2周龄离体橡胶苗的茎部用皮下注射器注入致癌农杆菌541/71进行接种，3周后形成肿瘤，8周后肿瘤直径可达2cm，该肿瘤切下后可在不含激素的MS基本培养基上自主生长，用TLC可检测到肿瘤组织中含有由农杆菌诱导形成的章鱼碱。肿瘤的形成包含了质粒的转移，并表明质粒携带的控制某些代谢物(如冠瘿碱、植物激素合成)的基因在肿瘤细胞中得到表达，这是最早关于橡胶树基因工程的报道。1994-1998年Arokiaraj等应用基因枪法和农杆菌介导法，都成功地将β-葡糖苷酸酶(GUS)和新霉素磷酸转移酶基因转入橡胶中，在扩繁的第3代无性系中仍正常表达，表现出高度的稳定性，而这正是转基因动植物所需具备的一个重要特征，初步建立了橡胶的遗传转化体系，从此，利用脱分化愈伤组织进行转化成了巴西橡胶转化的基本技术路线，但是转化效率极低。2000年法国热带农业研究中心的Montoro等人利用继代的易碎内珠被脱分化愈伤组织为受体进行转化，研究了钙在橡胶农杆菌转化中的作用，但并没有得到转基因植株。2000年中国橡胶研究所的李维国以花药脱分化愈伤组织为受体，将木薯SOD基因导入橡胶，并得到转基因胚状体和瓶苗，但转基因瓶苗不能增殖。2003年印度橡胶研究所的Jayashree等以花药脱分化愈伤组织为受体，利用农杆菌介导法将GUS基因和SOD基因成功转入橡胶中，并在转基因后代中稳定表达。2005年Montoro等在橡胶内珠被脱分化愈伤组织继代及相关悬浮培养技术的基础上，利用农杆菌介导法成功得到转基因植株，但转化过程中有大量玻璃化苗产生，相关组培技术还不完善。2006年中国热带农业科学院生物技术研究所陈雄庭等以GUS基因为报告基因，NPTII基因为筛选标记基因，用基因枪轰击橡胶花药脱分化愈伤组织进行转化实验，将GAI矮化基因导入巴西橡胶，对基因枪转化橡胶愈伤组织的方法进行了探索，并初步确定GAI基因已经整合到橡胶基因组中，但橡胶愈伤组织经过基因枪轰击后，褐化程度比较严重，胚状体再生率和出苗率都比较低。2007年中国热带农业科学院生物技术研究所彭明实验室以长期继代增殖的橡胶胚性愈伤组织为转化受体，过农杆菌介导法将新疆小拟南芥抗冻调节基因CBF及其下游功能基因COR15a转入橡胶组织中，并得到大量转基因胚状体。

20世纪70年代末我国科技工作者首次利用离体花药相继成功培育出花粉单倍体及花药二倍体植株，现在已可从花药、内珠被、子叶培养经过体细胞胚发生得到再生植株，但难以建立胚性细胞悬浮系和转化体系。

长期以来，以脱分化愈伤组织为受体进行基因枪或农杆菌转化是世界橡胶树遗传转化体系的基本方法，但这类方法转化效率极低，成为制约橡胶树基因工程研究的瓶颈，其存在的严重影响转化效率的因素主要有：脱分化愈伤组织诱导分化成熟胚的频率较低；脱分化愈伤组织不宜于继代增殖，继代后胚分化率明显下降；脱分化愈伤组织不适应转化操作，操作过程中愈伤组织容易破碎，农杆菌的毒害作用都容易导致组织褐化坏死；脱分化愈伤组织对抑菌剂和筛选剂很敏感，抑菌和筛选过程容易影响愈伤组织的生长和分化。

此外，多年的橡胶组织培养实践表明，茎干、叶等其它部位培养获得的愈伤组织难以诱导出正常的胚状体，一般不用作遗传转化。

发明内容

本发明的目的是提供一种橡胶树高效遗传转化方法，它是利用橡胶树组织培养，橡胶树花药和内珠被胚性愈伤组织诱导培养及继代增殖培养技术，并成功结合基因枪和农杆菌介导法，大大提高橡胶树遗传转化效率的方法。

本发明所设计的橡胶树胚性愈伤组织高效遗传转化方法包括：胚性愈伤组织的诱导培养过程、转化受体材料的继代增殖培养过程、遗传转化过程、抗性胚性愈伤组织的继代增殖培养过程、继代后的抗性胚性愈伤组织诱导成胚及成苗的培养过程。

1、胚性愈伤组织的诱导培养过程：在橡胶树花药组织培养或内珠被组织培养的基础上，选择花药或内珠被的脱分化愈伤组织接入胚性愈伤组织诱导培养基，进行暗培养，可从部分褐化的脱分化愈伤上初生鲜黄、松散、透明的胚性愈伤组织，这些胚性愈伤组织进一步诱导能大量形成成熟胚。所述胚性愈伤组织诱导培养基是以MS培养基为基础的培养基，并添加水解酪氨酸、麦芽糖、BA、Kt、NAA、GA、ABA。