[发明专利]黄色荧光染料及其合成方法与用途

权利要求书

1.具有如下结构通式（I）的黄色荧光染料：

      R₁、R₂选自氯、氟、溴 或 氢，n为3至7的正整数。

2.根据权利要求1所述黄色荧光染料，其特征在于：R₁或/和R₂为氯，n是4至6的正整数。

3.权利要求1所述的黄色荧光染料的合成方法，其特征是合成步骤如下：

(1) 中间产物取代荧光素缩合化合物的合成

取代间苯二酚与3，6-二氯苯甲三酸酐在酸性条件下缩合得到取代荧光素缩合产物；

(2) 中间产物取代新戊酸酯荧光素的合成

取代荧光素缩合产物与新戊酸酐酯化得到取代新戊酸酯荧光素；

(3) 中间产物取代6-羧基荧光素新戊酸酯二异丙铵盐的合成

取代新戊酸酯荧光素与二异丙胺合成得到取代6-羧基荧光素新戊酸酯二异丙铵盐；

(4) 中间产物取代6-羧基荧光素新戊酸酯的合成

取代6-羧基荧光素新戊酸酯二异丙铵盐酸化得到取代6-羧基荧光素新戊酸酯；

(5) 中间产物取代二叔戊酰基-6-羧基荧光素-N-羟基琥珀酰亚胺基碳酸酯的合成

取代6-羧基荧光素新戊酸酯与二琥珀酰亚胺碳酸酯酯化得到取代二叔戊酰基-6-羧基荧光素-N-羟基琥珀酰亚胺基碳酸酯；

(6) 中间产物取代6-(羧基酰胺基)-二叔戊酰基荧光素的合成

取代二叔戊酰基-6-羧基荧光素-N-羟基琥珀酰亚胺基碳酸酯与C₃-C₇的直链氨基酸取代合成得到取代6-(羧基酰胺基)-二叔戊酰基荧光素；

(7) 黄色荧光染料的合成。

4.如权利要求3所述的合成方法，其特征是：所述的取代间苯二酚具有如下结构：

      R₁、R₂选自氯、氟、溴 或 氢。

5.如权利要求3所述的合成方法，其特征是：步骤（1）中得到的取代荧光素缩合化合物不纯化直接进行步骤（2）反应合成取代新戊酸酯荧光素。

6.如权利要求3所述的合成方法，其特征是：步骤（5）中得到的取代二叔戊酰基-6-羧基荧光素-N-羟基琥珀酰亚胺基碳酸酯不纯化而直接进行步骤（6）反应合成取代6-(羧基酰胺基)-二叔戊酰基荧光素。

7.如权利要求3中所述的合成方法，其特征是，步骤（5）在三乙胺或吡啶的弱碱性条件下进行。

8.如权利要求3中所述的合成方法，其特征是，步骤（5）中，产物取代二叔戊酰基-6-羧基荧光素-N-羟基琥珀酰亚胺基碳酸酯依次使用pH=7的磷酸钠盐缓冲溶液、盐酸溶液及饱和食盐水溶液进行洗涤。

9.如权利要求3中所述的合成方法，其特征是，步骤（6）中，取代6-(羧基酰胺基)-二叔戊酰基荧光素通过色谱柱进一步纯化，色谱柱所用流动相溶剂为三氯甲烷和乙酸乙酯混合溶剂，固定相为53-75μm的柱层析硅胶。

10.权利要求1所述黄色荧光染料在蛋白质标记中的应用。