[发明专利]H3型流感病毒血凝素空间构象模拟抗原表位及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，涉及一种H3型流感病毒血凝素空间构象模拟抗原表位及其应用。

背景技术

流感病毒属正粘病毒科，为单股负链、分节段RNA病毒，基因组由8个节段组成，编码10种病毒蛋白，根据流感病毒内部蛋白抗原型的不同分为甲(A)、乙(B)、丙(C)三型，又根据流感病毒表面蛋白血凝素(HA)和神经氨酸酶抗原性的不同将A型流感病毒分为不同的血清亚型，现已发现15种不同的HA亚型(H1-H15)。H3型流感病毒可感染人、禽、猪、马等多种哺乳动物，1968年H3N2型流感病毒曾造成突发性流感大流行，严重危害公共安全。

血凝素是流感病毒最主要的表面抗原，它能够诱导机体产生相应的中和抗体以中和病毒的感染。血凝素以三聚体的形式镶嵌在病毒包膜上，每个单体由两个经二硫键连接的蛋白亚单位组成，它们来自于一条前体链(HA0)，经蛋白水解酶的切割而形成，分别命名为HA1和HA2，HA1负责病毒与宿主细胞受体的结合与吸附，病毒吸附完成以后，病毒粒子通过宿主细胞的内吞作用进入细胞，在体内酸性环境中，HA2的疏水性融合多肽转移到内体膜的靶位上，介导内体膜与病毒包膜的融合。每个HA单体都由球形的头部和颈部组成，其中球部在HA1亚单位内，颈部由全部HA2和部分HA1亚单位组成。

随着多肽疫苗研究的进展，H3型流感病毒HA的抗原表位逐渐成为研究的热点。抗原表位的定位常规方法是首先对抗原进行化学降解、修饰获得多肽片段，或合成一系列来源于抗原的多肽片段，通过检测这些多肽片段与相关抗体的结合活性而得到。这些方法比较费时费力并且只能寻找到序列表位。也有人用化学合成肽库的方法筛选抗原表位，但筛选难度较大，目的肽段不易富集，并且也不能筛选到空间构象表位。

目前对H3亚型流感病毒血凝素序列表位的研究已取得很大进展，已发现并经证实的T细胞表位(HA127-133)和B细胞表位(HA91-108)等。对B细胞表位而言，空间构象表位的意义远大于序列表位。然而至今仍未有对H3型流感病毒HA空间构象表位的报道。

噬菌体展示技术产生于1985年，Missouri大学的Smith博士首先在Science上报道了利用丝状噬菌体在体外表达外源基因，并使外源基因表达产物融合在噬菌体的外壳蛋白中形成融合蛋白，呈现在噬菌体表面。目前能用于蛋白质/多肽展示的噬菌体系统除丝状噬菌体展示系统外还有λ噬菌体展示系统、T4噬菌体展示系统和T7噬菌体展示系统。

噬菌体展示技术的要点是在噬菌体衣壳蛋白基因中插入外源基因，形成融合蛋白表达在噬菌体颗粒的表面，并使表达产物保持良好的空间构象；利用靶分子，采用适当的淘洗方法(亲和-洗脱-扩增-亲和的循环步骤)，洗去非特异型结合的噬菌体，使特异性结合的噬菌体富集，最终从文库中筛选出能结合靶分子的目的噬菌体；外源多肽或蛋白质表达在噬菌体的表面，其编码基因作为重组噬菌体基因组中的一部分可通过噬菌体DNA序列测序得到，这样就使表达蛋白(表现型)和编码基因(基因型)之间完美地结合起来，使研究者可以在基因分子克隆的基础上有效的实现蛋白质构象的体外控制，从而在体外获得具有良好生物学活性的表达产物。

常规的抗原表位定位方法费时费力且不能获得空间构象表位。而通过将抗原的基因片段进行随机降解后与噬菌体的外壳蛋白基因融合表达而构成一个展示于噬菌体表面的表位库或直接用商业化的噬菌体肽库，以抗原特异性抗体来进行筛选，然后分析能与特异性抗体结合的噬菌体肽的序列，再将其与天然抗原序列相比较，就很容易确定抗原表位的位置及序列。噬菌体展示技术更是确定空间构象类抗原表位的有效方法。以固定化的抗体为筛选分子，可获得与抗体高亲和力的肽段，肽段核心序列很可能是和抗体互补决定区相结合的特异性天然抗原表位序列相同或类似，即模拟了天然蛋白质的连续表位。若筛选到与抗体高特异性结合的肽段完全不同于天然抗原序列，则称这些肽段为模拟表型(mimotype)，它模拟天然蛋白一级结构上不连续的氨基酸经过空间折叠而形成的表位结构。

发明内容

本发明的目的是提供一种H3型流感病毒血凝素空间构象模拟抗原表位。该抗原表位是一种用噬菌体展示肽库与抗重组HA1兔血清IgG结合，筛选得到的由12个氨基酸残基构成的短肽。

本发明的另一目的是提供上述H3型流感病毒血凝素空间构象模拟抗原表位在制备H3型流感病毒的诊断试剂中的应用。

本发明的目的是通过下列技术措施实现的：

一种H3型流感病毒血凝素空间构象模拟抗原表位，该抗原表位是由12个氨基酸残基构成的短肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。