[发明专利]5’-核苷酸酶诊断试剂盒及5’-核苷酸酶活性浓度测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种5’-核苷酸酶诊断试剂盒，同时本发明还涉及测定5’-核苷酸酶活性浓度的方法，属于医学检验测定技术领域。

背景技术

医学研究表明，5’-核苷酸酶(5NT)增高主要见于阻塞性黄胆，也可见于肝癌和肝炎。在胆汁淤积并发胆管炎、原发性和继发性胆汁性肝硬化和慢性肝炎时，5NT升高率高于碱性磷酸酶；肝肿瘤和肝肉芽肿时5NT升高的敏感性高于碱性磷酸酶。因为5’-核苷酸酶活性无生理性升高，对于诊断婴幼儿肝病和妊娠性肝功胆汁淤积较碱性磷酸酶不但敏感，而且有特异性。因此测定5’-核苷酸酶的活性对于疾病的诊断具有重要意义。

5’-核苷酸酶的活性测定方法很多，主要有同位素底物法、化学强酸测磷法(1925年)。据申请人了解，目前国际上普遍采用同位素底物测试法，方法为：5’-核苷酸酶作用于H³-dUMP，终止反应后，通过离子交换层析柱分析结果，求得5’-核苷酸酶活性。或者利用5’-核苷酸酶作用于单磷酸腺苷后产生无机磷，再用化学强酸法分析无机磷含量得以计算出5’-核苷酸酶的活性。

同位素底物法方法复杂还有同位素污染，而且需要同位素测定仪，因此难以切实推广应用。无机磷测定法是1925年发明的方法，准确度不好，强酸污染环境等等，也不适合推广应用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提出一种利用酶比色法(EnzymaticColorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，连续监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定5’-核苷酸酶活性浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的5’-核苷酸酶诊断试剂盒，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行5’-核苷酸酶活性浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。

本发明5’-核苷酸酶活性浓度测定方法原理如下：

核苷单磷酸+水  5核苷酸酶  核苷+磷酸根

磷酸根+草酰乙酸  磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶  

                   二氧化碳+磷酸烯醇式丙酮酸+水

二氧化碳+丙酮酸+还原型辅酶  苹果酸脱氢酶(脱羧化)  

                                      L-苹果酸+辅酶

核苷单磷酸可以是：腺苷单磷酸、肌苷单磷酸、尿苷单磷酸等

这种方法应用5’-核苷酸酶(5‘-Nucleotidase；EC 3.1.3.5)酶(偶)联磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase；EC 4.1.1.31)、苹果酸脱氢酶(脱羧化)(malate dehydrogenase(decarboxylation)；EC 1.1.1.38；EC 1.1.1.39；EC 1.1.1.40；EC 1.1.1.83)酶促反应连续监测法。5’-核苷酸酶酶解核苷单磷酸反应产生磷酸根，再通过(偶)联合磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、苹果酸脱氢酶(脱羧化)的作用，最终将还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)氧化成为辅酶(在340nm处没有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度下降的速度，通过测量340nm处吸光度下降的速度，可以测算5’-核苷酸酶的活性浓度大小。

实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明5’-核苷酸酶诊断试剂较为理想：

缓冲液                       100mmol/L

稳定剂                   500mmol/L

还原型辅酶               0.25mmol/L

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶   10000U/L

苹果酸脱氢酶(脱羧化)     12000U/L

核苷单磷酸               8mmol/L

草酰乙酸                 12mmol/L

丙酮酸                   16mmol/L

本发明的5’-核苷酸酶诊断试剂盒可以是单剂，包括：