[发明专利]甘氨酸诊断/测定试剂盒及甘氨酸的浓度测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种甘氨酸诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定甘氨酸浓度的方法，属于医学/食品检验测定技术领域。

背景技术

甘氨酸是一种重要的精细化工中间体，广泛应用于农药、医药、食品、化肥、饲料等行业。根据甘氨酸的制备工艺和产品的纯度可分为食品级、医药级、饲料级和工业级四种规格产品。

在20多种氨基酸中，甘氨酸是最简单的一种，它是组成蛋白质的一种成分，为非人体必需氨基酸。《食品添加剂使用卫生标准》规定，甘氨酸允许使用的范围为调味料和豆奶，最大使用量是1g/kg。国家质检总局日前进行的一项专项监督检查结果表明，国内部分乳饮料企业为提高产品中蛋白质含量，在生产加工中违规使用价格低得多的甘氨酸代替奶粉，个别企业问题严重。据业内人士介绍，使用甘氨酸替代奶粉，可以使产品成本至少减少一半。人体若摄入甘氨酸的量过多，不仅不能被人体吸收利用，而且会打破人体对氨基酸的吸收平衡而影响其它氨基酸的吸收，导致营养失衡而影响健康。

目前各地方的检测标准均采用氨基氮测定法测定甘氨酸含量。较新的方法，采用HPLC法(高效液相色谱柱后衍生法)测定其中的甘氨酸。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提出一种利用酶双倍扩增法(EnzymaticDoubling Method)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及偶联法(Couple Reaction)技术，监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定甘氨酸浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的甘氨酸诊断/测定试剂盒，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行甘氨酸浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。

本发明甘氨酸浓度测定方法原理如下：

甘氨酸+2A  氰化氢合成酶  氰化氢+二氧化碳+2AH₂二氧化碳+乙酰辅酶A+还原型辅酶  丙酮酸脱氢酶  丙酮酸

+辅酶A+辅酶

丙酮酸+还原型辅酶  乳酸脱氢酶  L-乳酸+辅酶

A是电子受体，例如：柠檬酸铁(ferric citrate)、焦磷酸铁(ferricpyrophosphate)、延胡索酸(fumarate)、硫酸甲酯吩嗪(phenazinemethosulphate，PMS)、水合氧化铁(hydrous ferric oxide)、ferric hydrite等，但不仅限于上述举例。

这种方法应用氰化氢合成酶(hydrogen cyanide synthase；EC 1.4.99.5)偶联丙酮酸脱氢酶(pyruvate dehydrogenase；EC 1.2.1.51)、乳酸脱氢酶(Lactatedehydrogenase；EC 1.1.1.27；EC 1.1.1.28)酶促反应连续监测法/终点比色法。氰化氢合成酶酶解甘氨酸反应产生二氧化碳，再通过偶联丙酮酸脱氢酶及乳酸脱氢酶的作用，最终二次将还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)氧化成为辅酶(在340nm处没有吸收峰)，灵敏度增加二倍；从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度下降的程度/速度，通过测量340nm处吸光度下降的程度/速度，可以测算甘氨酸的浓度大小。

实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明甘氨酸诊断/测定试剂盒较为理想：

缓冲液                                  100mmol/L

稳定剂                                  500mmol/L

还原型辅酶                              0.25mmol/L

氰化氢合成酶                             10000U/L

丙酮酸脱氢酶                             16000U/L

乳酸脱氢酶                               16000U/L

硫酸甲酯吩嗪                             0.4mmol/L