[发明专利]一株海因酶和氨甲酰水解酶产生菌、双酶基因及制备L－氨基酸的应用

说明书

技术领域

本发明属于应用微生物技术领域，具体涉及一种同时产海因酶和L-N-氨甲酰水解酶的新微生物Bacillus fordii MH602菌株、该菌株所产的海因酶和L-N-氨甲酰水解酶基因、以及利用该菌株制备系列光学纯L-氨基酸的应用。

背景技术

天然L-氨基酸及非天然L-氨基酸及其衍生物在食品、医药、农业等行业有广泛应用研究。海因酶和L-N-氨甲酰水解酶是生产天然、非天然L-氨基酸及其衍生物的关键生物催化剂之一，特别适用于常规发酵法难以生产的人体必须氨基酸和非天然氨基酸。近年来，非天然L-氨基酸可作为功能蛋白抑制剂的成分，预防HIV感染、纤维蛋白原受体的多肽配体，速激肽拮抗剂、神经原受体配体等。非天然氨基酸广泛用于合成生物活性肽，作为天然氨基酸的代替品。因其改变的疏水侧链带来诸多好处而应用于多肽合成：阻止疏水口袋变小、亲油性高、稳定性高、蛋白酶难以降解。

不同微生物产生的海因酶或L-N-氨甲酰水解酶在底物特异性及热稳定性等方面同存在明显差异，因而导致不同微生物产生的海因酶或L-N-氨甲酰水解酶在工业应用方面存在重要差异。如Bacillus和Arthrobacter仅转化DL-5-甲硫乙基海因为L-蛋氨酸，而Pseudomonas可转化DL-对羟基苯海因生成D-对羟基苯甘氨酸。在生产相关L-氨基酸的工艺中，海因酶和L-N-氨甲酰水解酶热稳定性较低，特别是L-N-氨甲酰水解酶活性低，稳定性差，起到“瓶颈”的作用，如来自Agrobacterium的L-N-氨甲酰水解酶稳定性较差，30℃半衰期仅为lO分钟；来自嗜热古细菌Methanococcus属的海因酶虽然有较好的热稳定性，半衰期在90℃为100分钟，但该菌仅产海因酶且仅对海因有较好的催化效果。

不同微生物菌属所产生的海因酶或L-N-氨甲酰水解酶在基因序列上同样存在很大差异，数据中所报道的海因酶基因序列同源性仅为20～40％，相同菌属微生物物种所产海因酶同源性为40～90％，而L-N-氨甲酰水解酶同源性更低，同源性不超过40％，如来自Bacillus kaustophilus的L-N-氨甲酰水解酶(GeneBank接收号AF425838)，Arthrobater aurescens的L-N-氨甲酰水解酶(GeneBank接收号AF071221)，来自Pseudomona sp.NS671的L-N-氨甲酰水解酶(GeneBank接收号D90469)等。而D-氨甲酰水解酶与L-氨甲酰水解酶的同源性低于15％。

近年来，海因酶和L-N-氨甲酰水解酶用于研究开发相关产品，具有工艺简单、光学纯度高等特点，研究比较活跃。因此寻求高稳定性及高活性的海因酶与L-N-氨甲酰水解酶产生菌并研究海因酶系基因序列特征具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一株同时产海因酶和L-N-氨甲酰水解酶的菌株，该菌株产生的海因酶和L-N-氨甲酰水解酶能克服目前生物转化DL-5-取代海因或N-氨甲酰氨基酸制备L-氨基酸过程中海因酶和L-N-氨甲酰水解酶的活性和热稳定性较差的缺点，并将该菌株成功应用于L-氨基酸高效生产上。

为实现以上目的，本发明采用的技术方案主要分以下三部分：

一、本发明以DL-5-取代海因作为唯一氮源从土壤中筛选到一株能同时产海因酶和L-N-氨甲酰水解酶的菌株，分类命名为Bacillus fordii MH602，其保藏登记号为CCTCCNo：M 206144。

本发明将Bacillus fordii MH602经BIOLOG全自动细菌鉴定仪鉴定，表明该菌株MH602与芽孢杆菌Bacillus sp.相似度(SIM)为0.52，而16SrDNA序列分析鉴定表明与该序列相似度高于98％的菌株均为Bacillus属菌株，其中与菌株BacillusfordiiAY443039相似度为98.6％。

本发明对Bacillus fordii MH602的生物特征进行了鉴定，该菌株为革兰氏阳性菌，有芽孢形成。在肉汤平板培养基中生长16小时后，菌落大小为2～2.5mm，生长温度范围是40～55℃，最适温度是45℃，生长pH是6.5～8.5，最适pH是7.5，其生理生化表现在，过氧化物酶试验阳性，在有氧条件下生长。