[发明专利]一种耐有机溶剂碱性蛋白酶产生菌以及该耐有机溶剂碱性蛋白酶的基因和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种耐有机溶剂碱性蛋白酶产生菌以及其耐有机溶剂碱性蛋白酶基因，以及其在有机相中催化肽合成、拆分外消旋胺及氨基酸的应用，属于微生物学与酶学领域。

背景技术

蛋白酶自1914年被试验用于洗涤剂的添加成分以来，由于具有重要商业用途而被广泛关注。当今蛋白酶的产量占据酶市场的40％以上，广泛应用于洗涤剂、食品、制药、制革、诊断试剂、污水处理等领域。而且，据统计2005年后，蛋白酶的用量已大幅攀升。蛋白酶广泛存在于动物、植物、真菌及原核生物等所有生物中，其中微生物来源的蛋白酶占据目前蛋白酶生产总产量的2/3以上。微生物来源的蛋白酶又可根据酶的反应pH、活性基团的特征等分为金属蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶和丝氨酸蛋白酶等。

碱性蛋白酶(EC.3.4.21-24，99)定义为在中性至碱性pH范围具有活性的蛋白酶，该类酶具有丝氨酸活性中心(丝氨酸蛋白酶)或金属活性中心(金属蛋白酶)，其中又以碱性丝氨酸蛋白酶为具有重要商业用途的酶。丝氨酸蛋白酶通常在中性至碱性pH条件下具有活力，最佳活力时pH为7～11，该酶分子量通常较小，范围为18～35kDa。根据该酶对氧化型胰岛素β链的作用特异性而进一步分类，通常丝氨酸蛋白酶可分为胰凝乳蛋白酶类、枯草杆菌蛋白酶类、小麦丝氨酸羧肽酶II型蛋白酶和葡萄球菌蛋白酶等。

随着溶剂与酶工程技术的发展，人们发现酶在有机溶剂中能催化在水中的不能进行的某些反应。在正常水相条件下，蛋白酶催化肽键水解，但在水限制的介质中能逆转反应而促进肽键的形成。水解反应理论上可逆，而且有关肽键水解的研究表明，当采用某种机制使反应体系中产物浓度低于平衡浓度时即可克服水解逆反应的热力学障碍，使反应向肽合成方向进行。化学法催化肽合成长期以来在肽合成中占有重要地位，但化学法催化肽合成有明显的缺点，如：1.肽键形成过程中的消旋作用；2.对氨基酸侧链的保护及脱保护导致成本增加和产物减少；3.酰基供体等的回收利用；4.制备用于食品级肽的过程中存在有毒有机溶剂的潜在风险。

利用蛋白酶有机相催化肽合成有以下3种方式：a.含有水可溶性有机溶剂的水溶体系；b.有机-水双相体系；c.微水含量的有机溶剂体系。在方式a中，有机溶剂在反应体系中的含量对产量具有重要影响；在方式b中由于水相中的pH值易于调整以及可通过分离步骤使肽的合成能连续进行，因此，方式b最先成功应用于肽合成，如Aspartame^的前体物的合成。该反应以嗜热菌蛋白酶(thermolysin)为催化剂，在双相中合成前体二肽，含有底物(Z-L-Asp和L-PheOMe)的有机相被连续添加到反应器中，底物被萃取到含有酶的水相中，并在水相中合成前体二肽，然后二肽再被萃取到有机相中，使反应连续进行。由于水的存在促进了水解反应，成为酶促肽合成中的最大弱点，因此体系C成为最理想的体系。

酶法拆分手性化合物是目前国内外研究的重点和热点，酶催化的手性拆分技术，拥有其他拆分方法所不能比拟的众多优点，如催化活性高，耗能少对环境无污染，反应的副产物少，高专一性和选择性，拆分效率高等。

非天然存在的氨基酸大多为外消旋体，必须通过拆分才能得到旋光纯的对映体。与合成肽不同，大多数氨基酸的外消旋体不易用化学法拆分，而用酶法拆分更简单有效。目前尽管溶剂对酶活性和立体选择性的影响规律和机制尚不十分清楚，但是大量实验结果表明，通过改变溶剂可以调节酶的活性和选择性，改变酶的动力学特性和稳定性等酶学性质，通过溶剂的改变可以显著提高酶的催化活性和立体选择性。在蛋白酶催化的手性拆分反应中，尤其是在在不同类型的有机溶剂中，耐有机溶剂蛋白酶的分子结构刚性程度不同，立体选择性程度都有明显的差异。

蛋白酶在水相中催化的手性反应在许多不足之处，如水解副反应竞争强烈；酶用量相对较多，产物易覆盖在酶周围，造成扩散限制，因此在应用上受到限制。酶的选择性与溶剂的介电常数及偶极矩有较好相关性，酶在非水介质中与水中相比其分子内具有较强的非共价相互作用力，从而有高度的结构刚性。在有机溶剂中蛋白酶催化的手性拆分反应，尤其是两相体系中的酶法拆分有着产物旋光度高、副产物少、产品分离提纯简单等优点，并且通过改变有机溶剂控制酶分子的活性部位的刚柔程度，提高对映体选择性。