[发明专利]氨(离子)诊断/测定试剂盒及氨(离子)的浓度测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种氨(离子)诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定氨(离子)浓度的方法，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。

背景技术

氨测定的方法有微量扩散法、离子交换法、酶法和氨电极法等。目前应用最多的方法是酶法和基于离子选择电极的血氨测定仪分析法。

扩散法是标本碱化后，释放出NH₃，用酸滴定释放出的氨，或用Nessler反应形成棕黄色碘化双汞胺进行比色。这些方法需要碱化，内源性的氨形成造成影响，使其准确性和精密度受到影响，目前已很少应用；离子交换法比扩散法更准确，CV为8％～13％；离子选择电极法是利用NH₃扩散到电极表面，引起电极的PH发生变化进行测定，该方法的CV为3.5％～4.8％，回收率高。结合具体实际，应以酶法测定为实用。

检索中国专利，仅查出87105593.7专利申请公开了一种血氨测定速冻杯，却未发现比较理想的血氨测定方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提出一种利用酶比色法(Enzymatic

Colorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定氨(离子)浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的氨(离子)诊断/测定试剂盒，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行氨(离子)浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。

本发明氨(离子)浓度测定方法原理如下：

氨离子+谷氨酸+腺苷三磷酸谷氨酰胺合成酶谷氨酰胺+

                                          腺苷二磷酸+磷酸根

磷酸根+腺苷二磷酸+草酰乙酸丙酮酸羧化酶腺苷三磷酸+

                                               丙酮酸+二氧化碳

二氧化碳+还原型辅酶甲酸脱氢酶甲酸+辅酶

这种方法应用谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase；EC 6.3.1.2)酶(偶)联丙酮酸羧化酶(Pyruvate carboxylase；EC 6.4.1.1)、甲酸脱氢酶(Formatedehydrogenase；EC 1.2.1.2；EC 1.2.1.43)酶促反应终点比色法。谷氨酰胺合成酶酶解氨(离子)反应产生磷酸根、腺苷二磷酸，再通过(偶)联合丙酮酸羧化酶、甲酸脱氢酶的作用，最终将还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)氧化成为辅酶(在340nm处没有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度下降的程度，通过测量340nm处吸光度下降的程度，可以测算氨(离子)的浓度大小。

实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明氨(离子)诊断/测定试剂盒较为理想：

缓冲液                               100mmol/L

稳定剂                               500mmol/L

还原型辅酶                           0.25mmol/L

谷氨酰胺合成酶                       6000U/L

丙酮酸羧化酶                         8000U/L

甲酸脱氢酶                           10000U/L

谷氨酸                               10mmol/L

腺苷三磷酸                                 3mmol/L

草酰乙酸                                   5mmol/L

本发明的氨(离子)诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括：

缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、谷氨酰胺合成酶、丙酮酸羧化酶、甲酸脱氢酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、草酰乙酸。

试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。

也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂：