[发明专利]一种提高铜绿假单胞菌产鼠李糖脂的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种提高鼠李糖脂产量的方法。

背景技术

生物表面活性剂因其结构的多样性，无毒害或低毒害性以及可生物降解性而逐渐被人们重视，并正在某些方面逐步取代化学合成的表面活性剂。在城市生活垃圾堆肥领域，生物表面活性剂可以改善堆肥微环境，从而促进微生物对有机垃圾的分解，提高堆肥中垃圾的处理效率。然而，生物表面活性剂的生产成本昂贵，成为其在工业中被广泛采用的瓶颈。如能降低生物表面活性剂的生产成本，或者在同等生产成本下提高其产量，其在工业及环境污染治理中的应用将会更加广泛。

以往的文献资料中提到枯草芽孢杆菌产莎梵婷时利用固体状土豆培养基比溶解态的土豆培养基能有效提高其产量，粘质沙雷氏菌产一种脂肽类生物表面活性剂时加入硅胶能增加该脂肽类生物表面活性剂的产量，还有研究表明利用活性炭也能显著提高莎梵婷的产量。鼠李糖脂是铜绿假单胞菌产生的一类糖脂类生物表面活性剂，在工业领域以及环境堆肥中具有重要作用，如能在同等生产成本下提高其产量，无疑鼠李糖脂在工业及环境领域被更广泛地应用将成为一种可能。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术的不足，提供一种通过在发酵培养液中加入具有多孔疏松渗水结构的载体，从而提高铜绿假单胞菌产鼠李糖脂的方法。

为实现上述目的，本发明采用以下方案：

1、将冷藏的铜绿假单胞菌于30～37℃下活化24h后，接种于富集培养液中，在温度30～37℃，转速200～250rpm条件下培养24h，将富集后的菌种按体积分数2.5～5％接种于装有高效悬浮大孔载体的好氧发酵培养液中进行好氧发酵培养，培养温度30～37℃，200～250rpm，培养时间最好为48～60h，通过测定发酵液表面张力值的变化确定鼠李糖脂的产生以及好氧发酵培养时间(表面张力值越低以及稀释倍数越大而表面张力值仍保持不变的时间点产生的鼠李糖脂越多)；所述富集培养液成分为：NaCl 4.5～5.0g，蛋白胨4.5～5.0g，牛肉粉2.5～3.0g，蒸馏水1000mL，pH7.0～7.2；所述好氧发酵培养液组成为：葡萄糖20～25g，NaNO₃2.0～2.3g，KH₂PO₄1.5～1.8g，Na₂HPO₄·12H₂O1.5～1.8g，MgSO₄·7H₂O 0.8～1.0g，FeSO₄·7H₂O 0.01～0.015g，蒸馏水1000mL，pH6.5～6.8；取上述好氧发酵培养后的发酵液高速离心除菌，转速为8000～10000rpm，时间10～20min；取出适量上清液用作稀释测表面张力值以初步确定鼠李糖脂的产量为多少倍CMC；然后用HCl溶液调节剩余上清液pH1.5～2.0，再加入等体积的氯仿/甲醇(2∶1，体积比)的萃取剂，振荡、摇匀后、静置，上层液用同样的方法多次萃取，下层液合并后真空旋转蒸发，直到有机溶剂还剩下3～10mL；

2、取上述含鼠李糖脂的有机溶剂装于烧杯中(烧杯事先风干称重)，然后置于通风橱中风干，烧杯底上留下的棕黄色的粘稠油状物质即为鼠李糖脂。

本发明的优点：

本发明中载体的加入使铜绿假单胞菌生长量增大，鼠李糖脂产量增加，使得铜绿假单胞菌在工业中特别是环境污染的治理方面得到更为广泛的应用成为一种可能。在环境污染治理中的生活垃圾堆肥中，生物表面活性剂的加入将有利于改善堆肥微环境，促进微生物与有机物的接触密度和强度，提高易降解及难降解有机物的降解而提高堆肥效率。

由于生物表面活性剂生产成本昂贵，极大的限制了其在工业及环境方面的应用。先前的工作主要通过使用便宜的培养基来降低生产过程中的原材料成本，以及发展有效的生物处理过程、包括培养条件的优化及生物表面活性剂大量生产和回收的经济有效的分离过程来降低生产成本。这两种方法已经极大地得到了开发。目前，随着分子生物学及基因工程技术的发展，也有工作者通过开发并使用高产诱变菌种或重组菌种来提高生物表面活性剂产量，但由于其中使用的药剂昂贵，且大多具有致癌、致突变和致畸性，对人体和环境都会造成极大的毒害。

本发明中所使用的载体价格易于被人们接受，且对环境和人体均无毒害，同等培养条件下，与未加载体时相比，能增加铜绿假单胞菌的生物量，提高鼠李糖脂产量，使得其广泛应用于工业及环境领域成为一种可能。

附图说明

图1：实施例1中发酵液表面张力值随时间的变化情况；