[发明专利]利用伪狂犬病毒gE基因制备主要抗原区蛋白的方法

说明书

一、技术领域

本发明涉及医药领域，特别是一种利用伪狂犬病毒gE基因制备主要抗原区蛋白的方法。

二、背景技术

伪狂犬病是由伪狂犬病病毒引起的多种动物和野生动物的一种疾病，该病对猪危害最大，给养猪业造成了巨大的经济损失。在欧美等发达国家，主要采用基因缺失标志疫苗(Marker Vaccine)配合相应的血清学鉴别诊断方法来根除此病，在我国猪伪狂犬病的根除计划尚未启动。在大多数已启动伪狂犬病根除计划的国家中，主要采用针对gG，gE和gC这三种糖蛋白的鉴别诊断方法，其中又以gE缺失的疫苗和gE-ELISA鉴别诊断的应用最为广泛。但目前商业化应用的gE-ELISA试剂盒多采用细胞培养物来增殖病毒制备抗原，这种方法的成本高，劳动强度大，还存在散毒的危险。而近年来报道了用在杆状病毒系统中表达的gE蛋白作为抗原，大肠杆菌表达系统是人们应用最多，研究最为透彻的外源蛋白表达系统，大肠杆菌(Escherichia coli)表达系统的主要优点是其遗传背景和生化特性清楚、易于操作、生长迅速、培养基成本低、易于制备等。因此对于一些非糖基化蛋白或只要求其抗原性的蛋白，大肠杆菌表达系统是一个极好的选择。

三、发明内容

针对上述情况，本发明之目的就是提供一种利用伪狂犬病毒gE基因制备主要抗原区蛋白的方法，有效解决主要抗原区蛋白的制备，用于防制伪狂犬病毒对猪的危害问题，其解决的技术方案是，利用引物及伪狂犬病毒基因组DNA合成gE基因，对gE基因进行克隆(扩殖)，经连接产物和平板得白色菌落，再利用其菌落制得含有gE基因的质粒，再进行gE基因抗原区蛋白进行合成得目的片段和载体片段混合，加入大肠杆菌进行克隆(扩殖)得含有gE基因的阳性重组菌，再接种于培养液中培养得gE基因主要抗原区蛋白，该方法先进，易操作，其产品使用效果好，成本低，无毒副作用，是猪病诊断防治上的一大创造。

四、具体实施方式

以下结合实际情况，对本发明的具体实施方式作详细说明。

本发明在实施中，是由以下步骤实现的：

1.引物的设计与合成

PCR引物的设计根据报道的伪狂犬病毒MinA株gE基因的核苷酸序列，利用DNAStar和Primer5.0软件设计1对包含gE基因主要抗原表位区段(54～263位氨基酸)的引物，上游引物P1带有BamHI酶切位点，下游引物P2带有HindIII酶切位点，上、下游引物之间所扩增片段包括gE基因主要抗原区630个碱基，上、下游引物分别为：

上游引物P1(24mer)5′-AAGGATCCGACGATGACCTCAACG-3′

下游引物P2(24mer)5′-GCAAGCTTCAGCGTGGCAGTAAAG-3′；

2.伪狂犬病毒基因组DNA的提取

将MinA株伪狂犬病毒接种于PK-15细胞，待完全病变后，收集细胞悬液，10000r/min离心数秒，取沉淀液用适量细胞裂解液悬浮，加入蛋白酶K至最终质量浓度为100mg/L，在50℃作用3h，加入等体积的饱和酚，4℃，10000r/min，离心15min，重复2次；再用等体积的氯仿抽提一次；取上清液加入2.5倍体积的无水乙醇，-20℃沉淀3h；12000r/min离心10min；用70％的乙醇洗涤沉淀，自然干燥后加入含有Rnase的高纯水溶解得DNA，备用；

3.gE基因主要抗原区的获取

将上述基因组DNA在沸水浴中变性煮沸10min，取变性的DNA作为模板，反应体系为50μL，其中2×PCR缓冲液25μL，dNTPs  8μL，P1、P2(终浓度为20pmol/μL)各为1μL，Taq酶0.5U，扩增条件：94℃预变性1min；94℃预变性30s，50℃预变性30s，72℃预变性2min，如此30个循环，得gE基因；

4.gE基因的纯化

用DNA快速回收试剂盒回收DNA，方法如下：DNA片段经琼脂糖凝胶电泳分离，于长波紫外灯下切取含有目的片段的琼脂糖凝胶，放入一无菌的1.5mL的EP管中，加入3倍体积的溶胶液，于56℃水浴5-10min，其间轻弹EP管，使凝胶完全溶化，然后将溶化的液体转至收集管的UNIQ-10柱中，于室温静置2min，13000r/min，离心1min，倒掉收集管中的废液，用洗涤液洗两次，最后13000r/min离心2min，将回收柱转至一干净的1.5mL EP管中，加30uLTE洗脱，于室温放置2min，13000r/min离心1min，收集管中即为纯化的gE基因的DNA，备用；

5.对gE基因进行克隆(扩殖)