[发明专利]胸膜肺炎放线杆菌打孔质粒载体、其构建方法及在制备菌蜕中应用

权利要求书

1.一种胸膜肺炎放线杆菌打孔质粒载体pGZRS-E，其特征在于：由温敏调控基因cI857、噬菌体溶菌基因E和胸膜肺炎放线杆菌-大肠杆菌穿梭质粒载体pGZRS-18组成。

2.一种构建权利要求1的胸膜肺炎放线杆菌打孔质粒载体pGZRS-E的方法，包括：以噬菌体PhiX174双链DNA为模板，以SEQID NO.1和SEQID NO.2为引物进行PCR扩增，得到溶菌基因E；将溶菌基因E纯化后用T4 DNA连接酶与经EcoRI和BamHI双酶切消化的pBV220载体相连接，得到打孔质粒载体pBV E；以打孔质粒载体pBV-E为模板，以SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4为引物进行PCR扩增，将PCR扩增产物纯化后用BamH I和SacI双酶切，然后与同样双酶切的胸膜肺炎放线杆菌-大肠杆菌穿梭质粒载体pGZRS-18相连接，即得。

3.权利要求1的胸膜肺炎放线杆菌打孔质粒载体pGZRS-E在制备胸膜肺炎放线杆菌菌蜕中的应用，包括：将胸膜肺炎放线杆菌打孔质粒载体pGZRS-E电击转化到胸膜肺炎放线杆菌血清1型参考菌株shope 4074感受态细胞中，转化后涂布含Amp⁺的TSB琼脂平板，转化子通过菌落PCR进行鉴定；将含有打孔质粒载体pGZRS-E的胸膜肺炎放线杆菌接种到TSB肉汤液体培养基中，28℃过夜震荡培养，然后转接于含50μg/mL氨苄青霉素以及10％NAD的TSB肉汤液体培养基中，28℃震荡培养至OD_600nm达0.5左右；取出100μl培养物备用，将剩余培养物迅速调高到42℃培养以诱导E基因表达，继续培养5-7小时；取诱导前后的培养物各100μl适当稀释后涂TSB琼脂平板进行活菌CFU检测；溶菌结束后形成的ghost菌蜕用PBS洗涤3次，冻干保存。