[发明专利]千克级规模高纯度单唾液酸四己糖神经节苷脂的制备

说明书

所属技术领域

本发明涉及千克级规模高纯度单唾液酸四己糖神经节苷脂(GM1)的制备方法，属于生物医药领域。

背景技术

神经节苷脂(Gangliosides，GLS)是一类含唾液酸的酸性糖脂，为哺乳动物细胞膜的重要成分，其在脑组织中含量最高。神经节苷脂的组成十分复杂，不同的神经节苷脂所含的糖基的唾液酸的数目和连接方式不同，可用G代表神经节苷脂，M、D、T分别代表单、二、三唾液酸基，下标数字1、2、3分别代表四糖基、三糖基、二糖基神经酰胺，GM1就表示由单个唾液酸基和四糖基神经酰胺连接而成的神经节苷脂。研究表明，具有显著生物学功能的神经节苷脂是连接有单个唾液酸的GM1，具有促进神经重构(神经重塑，神经可塑性，Neuroplasticity)的作用，即通过促进各种形态、生化、组化、神经生理及行为参数的改善，最终可以加速神经修复，最大程度地恢复原有的神经功能，其对血管性或外伤性中枢神经系统损伤和帕金森治病有疗效。目前神经系统疾病的发病率很高且往往缺乏有效的治疗措施，象GM1等疗效确切、副作用小的新药具有广泛的市场需求，亟待研究开发并产业化。

1957年Folch等发明了分层技术从哺乳动物组织中提取分离神经节苷脂，但此方法获得的神经节苷脂成分复杂并且纯度低，其中提取的神经节苷脂中含有大量色素、磷脂、硫脂等其他脂类成分，无法应用于药品的制备。1976年Momoi.T等使用阴离子交换介质DEAE sephadex A-25和硅胶分离纯化神经节苷脂，使分离效率和产品纯度大大提高，他们首先将猪脑或牛脑绞碎后用丙酮脱水制成丙酮粉，再用氯仿-甲醇-水的混合溶液进行提取，使得率达到了14％，但还是得率低无法用于大规模生产。

CN1353112公开了单唾液酸四己糖神经节苷脂的高纯度制备工艺，他们用有机溶剂混合物从哺乳动物脑组织中提取总神经节苷脂，然后对提取液进行浓缩、酸水解、脱盐、交换柱层析，洗脱液层析后再进行反相柱层析，最终得成品。虽然根据此工艺可以得到纯度大于98％的GM1，然而工艺流程繁琐，耗费时间长，生产一批所需的时间长达6天，工业化生产成本太高，且提取纯化过程中应用了有毒溶剂氯仿，从而使药品的副作用增加。

CN1415756与CN1570080均公开了一种微尘物转化方法制备单唾液酸四己糖神经节苷脂，虽然有效利用并节省了动物脑组织，但工艺程序复杂，在发酵工艺中菌种条件要求苛刻，容易受到染菌，且成本在每克500元以上，工业化生产成本偏高。

由于GM1结构的复杂性和多变性，以及其它技术难题没有得到解决，利用人工合成或基因工程方法制备GM1的方法在短期内难以应用。因此，目前获取GM1的普遍方法是从动物脑组织中提取分离。然而，神经节苷脂种类多，在脑组织中含量少，特别是其分子组成、结构物理化学性质等因素十分相近，所以高纯度GM1的提取分离又一定难度，特别是大规模工业化提取工艺还未见有报道和应用。到目前为止，国内关于GM1提取分离的研究大多还处于实验室规模和水平，还未得到有效应用，采用的工艺主要有Momoi.T方法和利用微生物转化的方法，但成本太高，难以大规模应用于临床。国内还没有单一成分GLS如GM1的批量生产方法和工艺，现有的分离纯化方法多有操作步骤繁琐、工艺复杂、周期长、不宜大量制备等缺点。

发明内容

GM1价格昂贵的原因在于应用现有的技术工艺制备产量少，工艺复杂，如果采用易于获得的原料，对提取过程的几个关键步骤进行改良，使生产工艺适合大量制备以及产业化生产，或发展出新的先进分离纯化技术，则其成本将大大降低。本发明人为了达到上述目的，通过对现有的GM1提取纯化工艺进行研究，通过大量实验对现有技术不断改进，提出了本发明的技术方案。

本发明以新鲜猪脑组织为原料，利用大型提取罐、大孔吸附树脂、DEAESephadex A-25和硅胶层析构建了一套提取分离纯化千克级规模高纯度GM1的生产工艺。本发明选用新鲜猪脑组织经粉碎和高速匀浆，注入提取罐并加入甲醇水混合液搅拌提取，经板框过滤分离甲醇水层经大孔吸附树脂分离神经节苷总脂；通过水解神经节苷总脂提高GM1含量30％，再经DEAE Sephadex A-2 5和硅胶层析过的纯度高于98％GM1。

通过大量的实验对提取纯化工艺进行优化，本发明的制备工艺包括如下步骤：

1)  将新鲜猪脑组织经4000～6000rpm离心除游离水后，胶体磨粉碎，3000r/min高速匀浆20～40min，成乳胶状后，注入提取罐中并加入10倍体积的甲醇水(2∶0.8～2∶1/V∶V)溶液，低温2～8℃下搅拌过夜(12～24小时)，提取；