[发明专利]多环芳烃厌氧降解纯菌种的分离纯化方法与应用

说明书

技术领域

本发明属于受污染土壤与水的生物降解处理技术领域，特别涉及一种多环芳烃厌氧降解纯菌种的分离纯化方法与应用。

背景技术

多环芳烃(PAH)是一类具有致癌、致畸、致突变作用的有机物，在环境中分布广泛且具有生物难降解性因而引起人们的广泛关注。多环芳烃的好氧生物降解是最快的，并且已经分离驯化出多株好氧降解菌。然而，地下含水层或污染土壤通常是厌氧状态，使污染带中的好氧微生物被厌氧微生物所替代，因此，多环芳烃的厌氧生物降解比好氧生物降解更加可行且经济有效。由于多环芳烃厌氧降解菌种生长十分缓慢，世代周期较长，传统的好氧分离纯化方法不能适用于多环芳烃厌氧降解菌的分离，很多年来多环芳烃厌氧降解菌的分离纯化一直未能成功。由于难于分离到多环芳烃厌氧降解纯菌种，对多环芳烃的厌氧降解机理与过程研究不够深入，从而制约了多环芳烃污染土壤及地下水厌氧生物修复技术的进一步发展和应用研究。因此寻找一种能有效分离纯化多环芳烃厌氧菌的方法与技术非常有必要，对于治理和修复多环芳烃污染土壤及地下水有重要的意义。

到目前为止，国内还没有关于分离纯化多环芳烃厌氧降解菌种方法与技术方面的文献及专利报道。同时，由于多环芳烃特别是高于四环的稠环芳烃更难于被厌氧生物降解且对微生物有较高的毒性作用，使得传统厌氧微生物菌种的分离纯化方法无法适用于多环芳烃的厌氧降解纯菌种的分离纯化。同时，分离纯化的环境条件及过程参数选定等都与能否分离纯化成功有密切的关系，这些条件与参数都需要经过一系列的试验研究后才能确定出最佳范围。

发明内容

本发明的目的提供一种多环芳烃厌氧降解纯菌种的分离纯化方法与应用。其具体步骤如下：

(1)向体积为150～200mL的厌氧瓶内加入99mL基础培养基、1.0mL微量金属液、0.1mL维生素c溶液，为指示培养基的厌氧状态加入0.1mL刃天青溶液，用高纯氮气曝气3.5h后加入50～60mg Na₂S除去残余的氧，然后用氟化橡胶塞密封瓶口，并用螺旋瓶盖拧紧；其中基础培养基的组成为：NH₄Cl：1.2g·L^-1，KH₂PO₄：1.2g·L^-1，MgCl₂：0.15g·L^-1，CaCl₂·2H₂O：0.05g·L^-1；微量金属液的组成为：CoCl₂·6H₂O：30mg·L^-1，CuCl₂：0.15mg·L^-1，H₃BO₃：5.7mg·L^-1，MnCl₂·4H₂O：20mg·L^-1，Na₂MoO₄·2H₂O：2.5mg·L^-1，NiCl₂·2H₂O：1.5mg·L^-1，ZnCl₂：2.1mg·L^-1。

(2)在充满氮气的厌氧手套箱内向体积为80～100mL的厌氧瓶内加入50mL按步骤(1)配制的液体培养基、0.25～0.30g电子受体和0.65g琼脂，用氟化橡胶塞密封瓶口，并用螺旋瓶盖拧紧。然后在温度为121℃的高压锅中灭菌20分钟，在室温下冷却至55～60℃时，在充满氮气的厌氧手套箱中将其倒入体积为160mL的培养皿中，为除去培养基表面多余的水分将该培养皿在充满氮气的厌氧手套箱中放置2天。

(3)在充满氮气的厌氧手套箱内向步骤(2)中的培养皿中加入0.3mL浓度为2g/L的多环芳烃丙酮溶液，来回倾斜转动培养皿使多环芳烃的丙酮溶液均匀分布，为除去培养基表面的丙酮将该培养皿在充满氮气的厌氧手套箱中放置2天。

(4)在充满氮气的厌氧手套箱内向体积为20～25mL的厌氧瓶内加入10mL按步骤(1)配制的液体培养基和0.25g琼脂，用氟化橡胶塞密封瓶口，并用螺旋瓶盖拧紧。然后在温度为121℃的高压锅中灭菌20分钟，在室温下冷却至36～38℃。