[发明专利]短串联重复基因座的多重扩增

说明书

本申请是申请日为1999年11月24日、申请号为99813729.4、发明名称为“短串联重复基因座的多重扩增”的发明专利申请的分案申请。

相关申请的交叉参考

本申请是美国专利申请系列号08/632,575(申请日1996年4月15日)、现美国专利5,843,660(授权日1998年12月1日)的部分继续申请，而08/632,575又是1994年9月30日申请的美国专利申请系列号08/316,544的部分继续申请。这些申请的全文引入本文作参考。

联邦政府资助的研究或开发的声明

无

发明领域

本发明涉及检测基因组系统中的遗传标记。本发明特别涉及用聚合酶链反应或其它扩增系统同时扩增多个不同的多种形态的遗传基因座，以在一个反应中测定包含于多重系统中每个基因座的等位基因。

发明背景

DNA分型通常用于亲子鉴定，并用于确定马、狗及其它动物农作物的谱系。DNA分型还通常用于鉴别血液、唾液、精液及在犯罪场所或需要鉴定人类遗迹的其它地方发现的其它组织。DNA分型还用于临床测定骨髓移植的成功或失败及特殊癌组织的存在与否。DNA分型涉及分析具有感兴趣的特征、通常称为“标记”的基因组DNA的等位基因。目前所用的分型法被特异设计为检测和分析已知在群体中以至少两种不同形式显现的DNA标记的一或多个区域的长度和/或序列中的差异。此种长度和/或序列变异称为“多态性”。其中发生这种变异的DNA的任何区域(即“基因座”)称为“多态基因座”。本发明的方法和物质均设计为用于检测DNA的多个基因座，其中一些或全部是多态基因座。

就长度或序列而言充分多态的遗传标记，很久以来被试图用于鉴定身份应用中，如亲权认定及鉴别收集的用于法医分析的组织样品。这种标记及分析该标记的方法的揭示与开发，在以往许多年已进行了几个阶段的开发。

第一个鉴别的DNA变体标记是简单碱基取代，即简单序列多态性，其通常由Southern杂交分析检测。例如，描述设计用于用放射活性探针分析限制性内切酶消化的DNA的这种标记的鉴别的参考文献，参见Southern，E.M.(1975)，J.Mol.Biol.98(3)：503-507；Schumm，etal(1988)，American Journal of Human Geneties 42：143-159；及Wyman，A.and White，R.(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.77：6754-6758。

第二代标记是大小变体，即长度多态性，尤其“串联重复可变数”(VNTR)标记(Nakamura Y.et al.(1987).Science 235：1616-1622；及美国专利4,963,663，授予White等(1990)；美国专利5,411,859，4,963,663的继续，授予White等(1995))和“小卫星”标记(Jeffreys etal.(1985a)，Nature 314：67-73；Jeffreys et al，(1985b)Nature 316：76-79；美国专利5,175,082，发明人Feffreys)。VNTR和小卫星标记均含有以串联方式重复的几个相同序列的区域。核心重复序列长度为10-70个碱基，较短的核心重复序列称为“小卫星”重复，较长重复称为VNTRs。人群中不同个体含有不同数量的这些重复。VNTR标记通常比碱基取代多态性具有更高的多态性，有时在单一遗传基因座上呈现接近40或更多个等位基因。但是，仍需要限制酶消化及随后的Southern杂交分析等繁琐方法检测及分析大多数这种标记。

接下来的进展包括聚合酶链反应(PCR)(美国专利4,683,203，Mullis，K.B.)技术与分析VNTR基因座(Kasai，K.et al.(1990)JournalForensic Science 35(5)：1196-1200)的联合。可扩增的VNTR基因座被发现，其可不需Southern转移而被检测。扩增产物通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶分离，并通过在扩增期间掺入放射活性或通过用银或溴化乙锭后染色而检测。但PCR只能用于可靠扩增相对小的DNA区段，即仅可靠扩增长度在3000个碱基之下的DNA区段。(Ponce，M.& Micol，L.(1992)NAR 20(3)：623；Decorte R.et al.(1990)DNA CellBiol，9(6)：461-469)。结果，仅开发了非常少的可扩增VNTRs。