[发明专利]农杆菌介导马铃薯转hrap基因获得抗病性表达的方法

权利要求书

1.一种农杆菌介导马铃薯转hrap基因获得抗病性表达的方法，其特征在于：经过预培养的外植体接种于携带质粒pBI hrap的农杆菌LBA4404的菌液中浸染，浸染后的外植体经共培养、诱导愈伤、诱导生芽和生根培养选择，选择根选两次都能生根的试管苗扩繁后转移盆栽得转化植株，转化植株用PCR检测和Southern杂交检测方法筛选阳性植株，经活体抗病性接种鉴定获得抗病马铃薯植株。

2.如权利要求1所述农杆菌介导马铃薯转hrap基因获得抗病性表达的方法，其特征在于：所述农杆菌菌液是这样配制的：将携带质粒pBI hrap的农杆菌LBA4404菌液接种于附加100mg/L Kan、100mg/L Sm和100mg/L Rif的液体LB培养基，在摇床上28℃，中速培养至OD600值为0.4～0.5。

3.如权利要求2所述农杆菌介导马铃薯转hrap基因获得抗病性表达的方法，其特征在于：所述农杆菌LBA4404，携带质粒pBI hrap，含有新霉素磷酸转移酶基因NPTII和过敏反应促进蛋白基因hrap，hrap基因上游为35S启动子，下游为NOS终止子。

4.如权利要求1所述农杆菌介导马铃薯转hrap基因获得抗病性表达的方法，其特征在于：所述外植体的预培养是取培养3～4周、生长健壮的马铃薯组培苗叶片剪去边缘，剪成0.4-0.5cm2的小块，正面朝下接种于培养基中，在22～25℃暗培养2天，所述培养基的组成为：MS+2.0mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+0.2mg/L 2，4-D+16g/L蔗糖+6g/L琼脂。

5.如权利要求1所述农杆菌介导马铃薯转hrap基因获得抗病性表达的方法，其特征在于：所述外植体的浸染采用如下方法：预培养后的外植体接种于制备好的农杆菌菌液中，使外植体与农杆菌充分接触8～20分钟。

6.如权利要求1所述农杆菌介导马铃薯转hrap基因获得抗病性表达的方法，其特征在于：浸染后外植体是这样共培养的：从农杆菌菌液中取出外植体，用无菌滤纸吸干，接种于培养基中，在22～25℃暗培养2～3天，所述培养基组成为：MS+2.0mg/L6-BA+0.2mg/L NAA+0.2mg/L 2，4-D+16g/L蔗糖+6g/L琼脂。

7.如权利要求1所述农杆菌介导马铃薯转hrap基因获得抗病性表达的方法，其特征在于：所述外植体的诱导愈伤、诱导生芽和生根培养采用如下的步骤：将共培养后的外植体接入组成为MS+2～2.5mg/L 6-BA+0.1～0.5mg/L NAA+30g/L蔗糖+50mg/LKan+500mg/L Cb，附加0.6％琼脂，pH5.8的培养基中诱导愈伤；愈伤生长2～3周后转接入组成为MS+2.5mg/L 6-BA+5.0mg/L GA3+30g/L蔗糖+6g/L琼脂+50mg/L Kan+500mg/L Cb的BOA培养基中，在22±1℃、每天光照12小时、光照强度为12000LX的条件下诱导生芽，3～4周更换一次BOA培养基；待芽长至2～3厘米后，将芽切下接入MS+50mg/L Kan的抗性筛选培养基中，在22±1℃、光照强度为12000LX，光照周期为12小时光照/12小时黑暗的条件下培养生根。

8.如权利要求1所述农杆菌介导马铃薯转hrap基因获得抗病性表达的方法，其特征在于：所述PCR检测为：从转化植株叶片中提取DNA，以转化植株为模板，阳性农杆菌菌液为阳性对照，未转化叶片为阴性对照，以hrap基因引物I：5′-GTTGGAGTTGGAGGACGAGG- 3′和hrap基因引物II：5′-CGCGGATCCATGAAAATGAAGAACCTCTC-3′进行PCR扩增，筛选阳性植株。

9.如权利要求1所述农杆菌介导马铃薯转hrap基因获得抗病性表达的方法，其特征在于：所述Southern杂交检测方法为：从PCR检测为阳性的转化植株的叶片中提取DNA，用BglII酶切提取的DNA，1％琼脂糖电泳后，转膜，筛选阳性植株。

10.如权利要求1-9任一所述农杆菌介导马铃薯转hrap基因获得抗病性表达的方法，其特征在于：所述方法按如下步骤进行：

(1)菌液制备：将保存农杆菌LBA4404菌液接种于附加100mg/L Kan、100mg/L Sm和100mg/L Rif的液体LB培养基，在摇床上28℃，中速培养至OD600值为0.4，得农杆菌菌液，备用；

(2)预培养：取培养4周、生长健壮的马铃薯组培苗叶片，正面朝下接种于组成为MS+2.0mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+0.2mg/L 2，4-D+16g/L蔗糖+6g/L琼脂的培养基中，在22℃暗培养2天；

(3)浸染：预培养后的组培苗叶片接种于步骤(1)制备的携带质粒pBI hrap的农杆菌LBA4404的菌液中，使组培苗叶片与农杆菌菌液充分接触8分钟；

(4)共培养：取出组培苗叶片，用无菌滤纸吸干，接种于步骤(2)中的培养基中，在22℃暗培养2天；

(5)诱导愈伤、诱导生芽和生根培养：将共培养后的组培苗叶片接入组成为MS+2.5mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+30g/L蔗糖+50mg/L Kan+500mg/L Cb、附加0.6％琼脂、pH5.8的培养基中诱导愈伤；愈伤生长3周后转接入组成为MS+2.5mg/L 6-BA+5.0mg/LGA3+30g/L蔗糖+6g/L琼脂+50mg/L Kan+500mg/L Cb的BOA培养基中，在22℃、每天光照12小时、光照强度为12000LX的条件下诱导生芽，4周更换一次BOA培养基；待芽长至3厘米后，将芽切下接入MS+50mg/L Kan的抗性筛选培养基中，在22℃、光照强度为12000LX光照周期为12小时光照/12小时黑暗的条件下培养生根，选择根选两次都能生根的试管苗扩繁后转移盆栽得转化植株；

(6)PCR检测：采用SDS微量法从转化植株叶片中提取DNA，以转化植株为模板，阳性农杆菌菌液为阳性对照，未转化叶片为阴性对照，以hrap基因引物I：5′-GTTGGAGTTGGAGGACGAGG-3′和hrap基因引物II：5′-CGCGGATCCATGAAAATGAAGAACCTCTC-3′进行PCR扩增，筛选阳性植株；PCR反应体系是10碆uffer 2.5mL、10mM dNTPs 0.5mL、2.5U/mL Taq酶0.5mL、10mM基因引物I 0.5mL、10mM基因引物II 0.5mL和模板DNA 2mL，用去离子水补至25mL；PCR反应条件：94℃，7min；94℃，50s；53℃，50s；72℃，1min；30个循环；72℃，7min；4℃终止反应；

(7)Southern检测：采用CTAB法从经PCR检测为阳性的转化植株的叶片中提取DNA，用BglII酶切提取的DNA，1％琼脂糖电泳后，转膜，筛选阳性植株；

(8)抗病性鉴定：Southern阳性植株经活体接种鉴定获得抗病马铃薯植株。